doi: 10.15389/agrobiology.2020.1.194rus
УДК 634.8:632.08:577.2
Исследования выполнены в рамках государственного задания ВННИИВиВ «Магарач» РАН № 0833-2015-0019.
РАЗРАБОТКА НАБОРА РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ
ФИТОПЛАЗМЫ Candidatus Phytoplasma solani — ВОЗБУДИТЕЛЯ
ПОЧЕРНЕНИЯ ДРЕВЕСИНЫ МЕТОДОМ ПЦР В РЕАЛЬНОМ
ВРЕМЕНИ
С.А. БЛИНОВА1, А.А. ШВАРЦЕВ1, С.В. СЫКСИН1, Г.Н. БОНДАРЕНКО2,
И.Г. БАШКИРОВА2, С.М. ГОРИСЛАВЕЦ3, В.И. РИСОВАННАЯ3,
Е.П. СТРАНИШЕВСКАЯ3, В.А. ВОЛОДИН3, Я.И. АЛЕКСЕЕВ1, 3, 4
Представители Candidatus Phytoplasma (фитоплазмы) служат возбудителями более 600 заболеваний растений. На виноградных насаждениях Европы наибольший ущерб приносят возбудитель золотистого пожелтения винограда Candidatus Phytoplasma vitis Marzorati et al., 2006 и возбудитель почернения древесины Candidatus Phytoplasma solani Qualino et al., 2013. Сходство симптомов различных фитоплазмозов винограда друг с другом, а также с вирусными и бактериальными заболеваниями делает их визуальное определение до вида невозможным. Широкое распространение и высокая вредоносность фитоплазмозов требуют расширения исследований их эпифитотиологии. Впервые в России нами разработана тест-система для выявления фитопатогена Candidatus Phytoplasma solani и проведено ее сравнение с уже существующими системами диагностики по основным характеристикам. Нашей целью была разработка и апробация набора реагентов для выявления фитоплазмы Candidatus Phytoplasma solani, вызывающей заболевание почернения древесины винограда, методом полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ). В работе использовали образцы ДНК Candidatus Phytoplasma solani, полученные из коллекции Всероссийского центра карантина растений, и зараженный материал винограда. Фрагменты лозы, корней и листьев сортов Шардоне, Пино нуар и Бастардо магарачский с визуальными признаками заражения Candidatus Phytoplasma были отобраны в осенний период 2018 года с виноградных насаждений Южнобережного агроклиматического района полуострова Крым. Пробы состояли из листьев, фрагментов лозы и корней винограда. ДНК фитоплазмы выделяли согласно методике, рекомендованной EPPO, с модификациями, а также с помощью набора реагентов Цитосорб (ООО «Синтол», Россия). Классическую ПЦР и ПЦР-РВ проводили в реакционном буфере, в состав которого входили 3 мM MgCl2, 0,25 мM dNTP, 2,5 ед. SynTaq ДНК-полимеразы с антителами, ингибирующими активность фермента (ООО «Синтол», Россия). Для секвенирования ДНК Candidatus Phytoplasma solani сконструировали пару праймеров SolaSeq_F 5'-AACTTAACCTTTTAACTAGGGC-3' и SolaSeq_R 5'-CATCAAGGCATTTGCC-3'. Для определения аналитической чувствительности набора реагентов была создана векторная конструкция на основе плазмиды Pal2T(«Евроген», Россия) со вставкой целевой нуклеотидной последовательности Candidatus Phytoplasma solani размером 119 п.н. Специфичность набора реагентов проверяли на 37 образцах близкородственных и сопутствующих объектов. Разработанные праймеры на участок гена SecYпозволяли идентифицировать ДНК фитоплазмы Candidatus Phytoplasma solani всех штаммов, последовательности которых находились в базе данных GenBank NCBI Nucleotide на 16.01.2019. Нуклеотидная последовательность гена SecY, в отличие от рекомендованных для диагностики, имела более высокую специфичность и консервативность. Набор реагентов был испытан на разных приборах для ПЦР-РВ. Его аналитическая чувствительность составила не менее 15 копий на реакцию, аналитическая специфичность — 100 %. Ложноположительных результатов при анализе проб в присутствии ДНК других видов фитоплазм, а также сопутствующих микроорганизмов не выявлено. Ложноотрицательных результатов при анализе проб с наличием ДНК целевого организма также не получили. Разработанный набор был апробирован при анализе 194 образцов, предположительно зараженных Candidatus Phytoplasma solani, из шести различных мест произрастания. Во всех случаях специфичность выявления фитоплазмы, вызывающей почернение древесины, подтвердило секвенирование ДНК образцов, положительных по гену SecY. Таким образом, разработанный набор реагентов позволяет быстро, точно и с высокой чувствительностью проводить диагностику инфицированности растений фитоплазмой Candidatus Phytoplasma solani на всех этапах вегетации (в том числе тестировать посадочный материал) и может использоваться для полномасштабных скрининговых исследований.
Ключевые слова: фитоплазма, Candidatus Phytoplasma solani, виноград, ПЦР в реальном времени, диагностика, ПЦР-РВ тест-система, специфичность, чувствительность, воспроизводимость, повторяемость.
S.A. Blinova1, A.A. Shvartsev1, S.V. Syksin1, G.N. Bondarenko2,
I.G. Bashkirova2, S.M. Gorislavets3, V.I. Risovannaya3, E.P. Stranishevskaya3, V.A. Volodin3, Ya.I. Alekseev1, 3, 4
Today, phytoplasmas are causative agents of about three hundred different plant diseases. The greatest damage in European vineyards is due to two types of phytoplasmas, Candidatus Phytoplasma vitis Marzorati et al. 2006, the pathogen of flavescence dorée of grapevine, and Candidatus Phytoplasma solani Qualino et al., 2013, the causative agent of black wood of grapevine. Phytoplasma damage of vineyards can lead to crop losses of up to 25-30 %, and when infected up to 70 %, the vineyards should be completely uprooted. Symptoms of various phytoplasma diseases in grape are similar with each other and with viral and bacterial diseases that makes their visual differentiation to species impossible. The wide spread and high damage by phytoplasma diseases require deeper research of phytoplasma epidemiology and relevant molecular genetic diagnostic methods for monitoring phytopathogen in planting material. We have developed the first Russian kit for detection these pathogens by real-time polymerase chain reaction (Real-Time PCR) which allows effective identification of Candidatus Phytoplasma solani. A comparison of the developed kit with the recommended primers and probes for Real-Time PCR has shown a higher sensitivity and specificity as compared to existing diagnostic PCR systems. The goal of this work was to develop and test a kit for the detection of Candidatus Phytoplasma solani by the real-time polymerase chain reaction (qPCR). Candidatus Phytoplasma solani DNA samples and infected grape vines, roots and leaves of Chardonnay, Pinot noir and Bastardo Magarachsky varieties with visual signs of infection collected in the autumn of 2018 from the vineyards of the South Coast region of the Crimean peninsula were tested. Phytoplasma DNA was extracted as recommended by EPPO, with modifications, as well as with Cytosorb reagent kit (Syntol LLC, Russia). A pair of primers, SolaSeq_F 5'-AACTTAACCTTTTAACTAGGGC-3' and SolaSeq_R 5'-CATCAAGGCATTTGCC-3', was designed for Candidatus Phytoplasma solani DNA sequencing. To estimate the analytical sensitivity of the test system, a vector construct based on the Pal2T plasmid (Evrogen, Russia) was created with the insertion of the Candidatus Phytoplasma solani target 119 bp fragment of SecY gene. The sequence of SecY gene is conservative, unlike other genes recommended for diagnosis. The designed primers allow identification of all Candidatus Phytoplasma solani strains which sequences we found in the GenBank NCBI Nucleotide database on January 16, 2019. The developed reagent kit was tested using various Real-Time PCR instruments. We have assessed the main characteristics of the reagent kit, i.e. sensitivity, specificity, and reproducibility. Analytical sensitivity of the developed test system isn’t less than 15 copies per PCR reaction. The analytical specificity was 100 % when tested with 37 closely related and accompanying microorganisms, as well as four samples of grapes suspected to be infected by Candidatus Phytoplasma solani. There were no false-positive results in the analysis of other types of phytoplasmas and related microorganisms. Also, in analyzing target organism DNA samples, false-negative results were not found. The developed kit was tested on 194 samples of grapes suspected of being infected by Candidatus Phytoplasma solani. The specificity of Candidatus Phytoplasma solani detection was confirmed in all cases by DNA sequencing of positive samples. The developed kit allows rapid, accurate and high sensitive DNA identification of Candidatus Phytoplasma solani in plants at all stages of their vegetative development, including planting material, and can also be used for full-scale screening studies.
Keywords: phytoplasma, Candidatus Phytoplasma solani, grapes, real-time PCR, diagnostics, qPCR test kit, specificity, sensitivity, reproducibility, repeatability.
1ООО «Синтол», |
Поступила в редакцию |
