doi: 10.15389/agrobiology.2023.6.1057rus
УДК 639.212:575.174.4
Работа выполнена при поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации. Государственное задание № FGGN-2022-0007.
РАЗРАБОТКА МУЛЬТИПЛЕКСНОЙ ПАНЕЛИ МИКРОСАТЕЛЛИТОВ ДЛЯ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ПАСПОРТИЗАЦИИ СИБИРСКОГО ОСЕТРА (Acipenser baerii)
Н.В. БАРДУКОВ, А.К. НИКИПЕЛОВА, А.А. БЕЛОУС ✉,
Н.А. ЗИНОВЬЕВА
Сибирский осетр (Acipenser baerii Brandt, 1869) — один из наиболее значимых видов рыб аквакультуры в России. Благодаря высокому спросу на ценную товарную продукцию, разведение сибирского осетра — перспективное направление в развитии отрасли. Однако селекционно-племенную работу с этим видом существенно осложняет наличие тетраплоидного генома, что в совокупности с необходимостью смешивания икры и спермы от нескольких производителей при получении потомства препятствует введению в практику хорошо зарекомендовавших себя молекулярно-генетических методов, таких как микросателлитный анализ. В настоящей работе впервые дана характеристика известным микросателлитным локусам у сибирского осетра с точки зрения возможности эффективного учета доз их аллелей в тетраплоидном геноме. Обнаружено семь локусов, соответствующих этому критерию. Целью нашей работы стало создание панели микросателлитных маркеров, адаптированной для использования в селекции сибирского осетра ленской популяции. Исследования проводили в 2023 году. В качестве биологического материала использовали срезы плавниковой ткани сибирского осетра ленской популяции, взятые от рыб экспериментального стада, содержащегося в установке замкнутого водоснабжения ФИЦ животноводства — ВИЖ им. академика Л.К. Эрнста. Экспериментальное стадо содержало две группы: I — рыбы, полученные на Можайском производственно-экспериментальном рыбоводном заводе (д. Горетово, Можайский городской округ, Московская обл.; n = 42), II — рыбы, полученные от ООО РТФ «Диана» (рабочий пос. Кадуй, Кадуйский р-н, Вологодская обл.; n = 47). ДНК выделяли помощью набора ДНК-Экстран-2 (НПК «Синтол», Россия) согласно протоколу фирмы-производителя. Качественную оценку ДНК осуществляли методом электрофореза в агарозном геле (1,2 % агарозы). ПЦР выполняли на амплификаторе Thermal Cycler SimpliAmp («Thermo Fisher Scientific, Inc», США). Электрофоретическое разделение продуктов амплификации проводили в системе капиллярного электрофореза Нанофор 05 (НПК «Синтол», Россия). Размеры аллелей определяли с помощью программного обеспечения GeneMаrker (Version 3.0.1). Для каждого локуса определяли дозу каждого аллеля. Для тестирования использовали 27 микросателлитных маркеров: Ls 19, Aox 45, Aox 9, Ls 68, Agu 38, Ag 49a, Agu 37, Agu 41, Agu 15, Agu 51, Agu 59, Agu 34, Agu 36, Agu 46, Agu 56, Agu 54, AoxD 161, AfuG 63, AfuG 51, AfuG 112, An 20, Aru 13, Aru 18, Afu 68 b, Spl 163, AfuG41, Ls 39, ранее известных для осетровых видов рыб. Из них для включения в мультиплексные панели было отобрано семь (Agu 38, An 20, Aru 18, Ls 19, Ag 49a, Agu 37, Agu 41). На основании полиморфизма семи микросателлитных локусов для двух исследуемых групп особей сибирского осетра был выполнен расчет классических популяционно-генетических показателей: среднего числа аллелей на локус (Na = 6,86), числа эффективных аллелей (Ne = 3,61), наблюдаемой (Ho = 0,839) и ожидаемой (He = 0,6535) гетерозиготности. Выявлено отсутствие инбридинга в исследуемых группах (FIS = -0,340 и -0,173), а также наличие значительной генетической дифференциации между ними: значение генетической дистанции M. Nei составило 0,1340, индекс Fst = 0,0796. Группы сформировали два четких, практически не пересекающихся кластера на PCA-плоте, несмотря на то, что предки особей сибирского осетра у обеих групп имели изначально родственное происхождение. Был оценен вклад дозы аллеля тетраплоидного локуса в эффективность микросателлитного анализа: в среднем информативность каждого локуса повышалась на 32 %. Сопоставление результатов генетического анализа с имеющимися данными литературы позволяет предположить, что в аквакультуральных стадах сибирского осетра ленской популяции происходят процессы, связанные с изменением частот аллелей микросателлитных локусов, которые постепенно усиливают их генетическую дифференциацию. В результате работы была подтверждена высокая эффективность созданных панелей микросателлитных маркеров и их потенциальная пригодность для использования в генетической паспортизации — каждая особь сибирского осетра имела собственный генетический профиль. Распределение аллелей семи микросателлитных локусов указывало на формирование уникальной генетической структуры в стадах сибирского осетра в каждом из двух рыбоводных предприятий, которые были источниками рыбопосадочного материала.
Ключевые слова: микросателлиты, тетраплоиды, сибирский осетр, осетроводство, нуль-аллели.
N.V. Bardukov, A.K. Nikipelova, A.A. Belous ✉, N.A. Zinovieva
The Siberian sturgeon (Acipenser baerii Brandt, 1869) is one of the most important aquaculture fish species in Russia. Due to the high demand for valuable commercial products, breeding of Siberian sturgeon is promising in the industry. However, breeding this species is significantly complicated by because of its tetraploid genome, which, together with the need to mix fidh roe and sperm from several producers when obtaining offspring, prevents the introduction into practice of well-proven molecular genetic methods, e.g. microsatellite analysis. In this work, for the first time, the known microsatellite loci in the Siberian sturgeon are characterized from the point of view of the possibility of effectively accounting for the doses of their alleles in the tetraploid genome. Seven loci were found that met this criterion. The goal of our work was to create a panel of microsatellite markers adapted for use in the selection of Siberian sturgeon from the Lena population. The research was carried out in 2023. As biological material, we used sections of fin tissue of the Siberian sturgeon of the Lena population, taken from the fish of an experimental herd kept in a closed water supply installation of the Ernst Federal Research Center for Animal Husbandry. The experimental herd contained fish from the Mozhaisk production and experimental fish hatchery (Goretovo village, Mozhaisk urban District, Moscow Province; group I, n = 42) and fish obtained from RTF Diana LLC (village Kaduy, Kaduysky District, Vologda Province; group II, n = 47). DNA was isolated using the DNA-Extran-2 kit (NPK Synthol, Russia) according to the manufacturer’s protocol. Qualitative assessment of DNA was carried out by electrophoresis in 1.2 % agarose gel. PCR was performed in a Thermal Cycler SimpliAmp amplifier (Thermo Fisher Scientific, Inc, USA). Electrophoretic separation of amplification products was carried out in a Nanofor 05 capillary electrophoresis system (NPK Synthol, Russia). Allele sizes were determined using GeneMarker software (Version 3.0.1). For each locus, the dose of each allele was determined. Twenty seven microsatellite markers known for sturgeon fish species were used (Ls 19, Aox 45, Aox 9, Ls 68, Agu 38, Ag 49a, Agu 37, Agu 41, Agu 15, Agu 51, Agu 59, Agu 34, Agu 36, Agu 46, Agu 56, Agu 54, AoxD 161, AfuG 63, AfuG 51, AfuG 112, An 20, Aru 13, Aru 18, Afu 68 b, Spl 163, AfuG41, and Ls 39). Of these, seven were selected for multiplex panels (Agu 38, An 20, Aru 18, Ls 19, Ag 49a, Agu 37, Agu 41). Based on the polymorphism of seven microsatellite loci for the two studied groups of Siberian sturgeon individuals, classical population genetic indicators were calculated, the average number of alleles per locus (Na = 6.86), the number of effective alleles (Ne = 3.61), observed (Ho = 0.839) and expected (He= 0.6535) heterozygosity. In the studied groups, inbreeding was not revealed (FIS = -0.340 and -0.173) while a significant genetic differentiation occurred (Nei’s GD = 0.1340, Fst = 0.0796). The groups formed two clear, practically non-overlapping PCA clusters despite the fact that the ancestors of Siberian sturgeon individuals in both groups were of related origin. The contribution of the allele dose of the tetraploid locus to the efficiency of microsatellite analysis was assessed. On average, the information content of each locus increased by 32 %. A comparison of the results of genetic analysis with the available research publications allows us to assume that in aquaculture herds of Siberian sturgeon from the Lena population, processes associated with changes in allele frequencies of microsatellite loci occur, which gradually enhance their genetic differentiation. As a result of the work, the high efficiency of the created panels of microsatellite markers and their potential suitability for use in genetic certification were confirmed, each individual Siberian sturgeon had its own genetic profile. The distribution of alleles at seven microsatellite loci indicated a unique genetic structure in Siberian sturgeon stocks in each of the two fish hatcheries that were sources of fish seeding material.
Keywords: Siberian sturgeon, microsatellites, tetraploids, sturgeon breeding, null alleles.
ВИЖ им. академика Л.К. Эрнста, |
Поступила в редакцию |
