doi: 10.15389/agrobiology.2020.4.816rus
УДК 579.62:579.852.11:615.33:575.113
Исследование выполнено при поддержке гранта РФФИ № 19-316-90041 «Полногеномное секвенирование штаммов бацилл, выделенных из рубцового содержимого различных жвачных животных».
ГЕНОМНЫЙ И ФЕНОТИПИЧЕСКИЙ ПОТЕНЦИАЛ АНТИМИКРОБНОЙ АКТИВНОСТИ ШТАММА БАКТЕРИИ Bacillus megaterium В-4801
Г.Ю. ЛАПТЕВ1, Е.А. ЙЫЛДЫРЫМ2, Т.П. ДУНЯШЕВ1, Л.А. ИЛЬИНА2,
Д.Г. ТЮРИНА2, В.А. ФИЛИППОВА2, Е.А. БРАЖНИК2, Н.В. ТАРЛАВИН2,
А.В. ДУБРОВИН2, Н.И. НОВИКОВА2, В.Х. МЕЛИКИДИ2, С.Н. БИКОНЯ2
Генетические детерминанты штаммов бактерий Bacillus sp., определяющие возможность биосинтеза разнообразных антимикробных соединений, представляют особый научный интерес, поскольку благодаря им эти микроорганизмы нашли широкое применение в качестве основы пробиотиков. Важный этап системного анализа механизмов пробиотического действия, в частности антимикробной активности микроорганизмов, — реконструкция его метаболической карты, то есть сбор и визуализация всех потенциально возможных процессов в клетке. В представленной работе впервые описаны потенциально заложенные генетические механизмы синтеза ряда биологически активных веществ у выделенного нами ранее штамма бактерии Bacillus megaterium В-4801, в частности возможность синтезировать каносамин — бактериоцин, относящийся к группе аминогликозидов, который может выполнять важную роль в реализации пробиотических свойств благодаря выраженной антимикробной активности. Нашей целью было изучение антимикробной активности штамма Bacillus megaterium В-4801 в отношении патогенных и условно-патогенных бактерий, а также поиск генов, связанных с антимикробной активностью, на основе полногеномного секвенирования. Штамм B. megaterium В-4801, депонированный в коллекции ООО «БИОТРОФ+», обладает выраженной пробиотической активностью. Антимикробную активность в отношении Staphylococcus aureus, Candida tropicalis, Clostridium sp., Escherichia coli оценивали методом отсроченного антагонизма (метод «колодцев»). Библиотеку ДНК для полногеномного секвенирования готовили с помощью набора Nextera XT («Illumina, Inc.», США). Нуклеотидные последовательности определяли с использованием прибора MiSeq («Illumina, Inc.», США) и комплекта реактивов MiSeq Reagent Kit v3 (300-cycle) («Illumina, Inc.», США). Недостоверные последовательности и адаптеры удаляли с помощью программы Trimmomatic-0.38. Отфильтрованные по длине не менее от 50 до 150 п.н. парноконцевые последовательности собирали de novo с использованием геномного сборщика SPAdes-3.11.1. Функциональную аннотацию генома проводили в программах PROKKA 1.12 и RAST 2.0. Оценку пула генов, связанных с антимикробной активностью, и построение метаболической карты выполняли с помощью базы данных KEGG Pathway (http://www.genome.jp/kegg/). Культуральными методами была выявлена антагонистическая активность B. megaterium В-4801 в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов. Зоны задержки роста тест-штаммов составляли от 2±0,15 до 25±1,4 мм. Геном штамма B. megaterium В-4801 был представлен одной кольцевой хромосомой размером 6 113 972 п.н., содержащей 37,5 % ГЦ-пар. Показано, что более 45 % генов B. megaterium В-4801 вовлечены в функции транспорта и метаболизма аминокислот, транскрипции, трансляции, транспорта и метаболизма углеводов, белков. Определены ключевые генетические локусы, детерминирующие синтез антимикробных метаболитов. В составе генома секвенированного штамма локализованы гены (FabD, FabF, FabG, FabZ, FabI и др.), связанные с продукцией белков, участвующих в синтезе алифатических ненасыщенных карбоновых кислот с числом углеродных атомов от 3 до 18, в частности масляной, капроновой, каприловой, каприновой, лауриновой, миристиновой, пальмитиновой, стеариновой, олеиновой. Согласно имеющимся сведениям, все эти вещества обладают выраженными антимикробными свойствами. Кроме того, нами обнаружен целый кластер генов (Asm22-24, Asm43-45, Asm47), связанных с биосинтезом бактериоцина каносамина, который относится к группе аминогликозидов, а также поликетидных ансамициновых антибиотиков из группы макролидов. Установленный пробиотический потенциал свидетельствует о роли исследованного штамма как потенциального кандидата в качестве основы для пробиотиков, в том числе для использования в животноводстве. Проведенный геномный анализ выявил новые системы оперонов, контролирующих метаболические пути синтеза антимикробных веществ, ранее не описанные для B. megaterium.
Ключевые слова: полногеномное секвенирование, Bacillusmegaterium, биосинтез жирных кислот, бактериоцины, антимикробная активность, каносамин, ансамициновые антибиотики, пробиотики.
G.Yu. Laptev1, E.A. Yildirim2, T.P. Dunyashev1, L.A. Ilyina2, D.G. Tyurina2, V.A. Filippova2, E.A. Brazhnik2, N.V. Tarlavin2, A.V. Dubrovin2, N.I. Novikova2, V.K. Melikidi2, S.N. Bikonya2
The genetic determinants of bacterial strains Bacillus sp., which determine the possibility of biosynthesis of various antimicrobial compounds, are of particular scientific interest, since thanks to them these microorganisms are widely used as the basis of probiotics. An important stage in the systemic analysis of the mechanisms of probiotic action, in particular the antimicrobial activity of microorganisms, is the reconstruction of its metabolic map, that is, the collection and visualization of all potential cell processes. In this work, for the first time, the potentially inherent genetic mechanisms for the synthesis of a number of biologically active substances in the bacterial strain Bacillus megaterium are described, in particular, the possibility of synthesizing canosamine, a bacteriocin belonging to the aminoglycoside group, which can play an important role in the implementation of probiotic properties due to its pronounced antimicrobial activity. Our goal was to study the antimicrobial activity of the strain Bacillus megaterium B-4801 against pathogenic and opportunistic bacteria, as well as to search for genes associated with antimicrobial activity based on whole genome sequencing. The B. megaterium B-4801 strain deposited in the collection of OOO BIOTROF+, possesses a pronounced probiotic activity. Its antimicrobial activity against Staphylococcus aureus, Candida tropicalis, Clostridium sp., and Escherichia coli was assessed by the method of delayed antagonism using wells. A DNA library for whole genome sequencing was generated using Nextera XT kit (Illumina, Inc., USA). Nucleotide sequences were determined using a MiSeq instrument (Illumina, Inc., USA) and MiSeq Reagent Kit v3 (300-cycle) (Illumina, Inc., USA). Invalid sequences and adapters were removed using the Trimmomatic-0.38 program. Filtered in length from 50 to 150 bp pair-terminal sequences were assembled de novo using genomic assembler SPAdes-3.11.1. Functional annotation of the genome was performed with PROKKA 1.12 and RAST 2.0 programs. The pool of genes associated with antimicrobial activity was assessed and the metabolic map was constructed using the KEGG Pathway database (http://www.genome.jp/kegg/). The antagonistic activity of B. megaterium B-4801 against pathogenic and opportunistic microorganisms was revealed by cultural methods. The growth inhibition zones of the test strains ranged from 2±0.15 to 25±1.4 mm. The genome of the B. megaterium B-4801 strain is a single circular chromosome with a size of 6,113,972 bp, containing 37.5 % GC pairs. More than 45 % of B. megaterium B-4801 genes are involved in the transport and metabolism of amino acids, transcription, translation, transport and metabolism of carbohydrates and proteins. The key genetic loci that determine the synthesis of antimicrobial metabolites have been identified. The sequenced genome of the strain contains genes (FabD, FabF, FabG, FabZ, FabI, etc.) associated with the production of proteins involved in the synthesis of aliphatic unsaturated C3-C18 carboxylic acids, in particular, butyric, nylon, caprylic, capric, lauric, myristic, palmitic, stearic, oleic. According to the information accumulated by world science, all these substances have pronounced antimicrobial properties. The whole-genome sequencing also discovered a cluster of genes (Asm22-24, Asm43-45, and Asm47) associated with the biosynthesis of bacteriocin kanosamin, which belongs to the aminoglycoside group, and polyketide ansamycin antibiotics from the macrolide group. The established probiotic potential indicates the role of the investigated strain as a potential probiotic candidate, in particular for use in animal husbandry. The performed genomic analysis revealed new systems of operons that control the metabolic pathways for the synthesis of antimicrobial substances, which were not previously described for B. megaterium.
Keywords: whole-genome sequencing, Bacillus megaterium, acid biosynthesis, bacteriocins, antimicrobial activity, canosamine, ansamycin antibiotics, probiotics.
1ФГБОУ ВО Санкт-Петербургский государственный |
Поступила в редакцию |
