doi: 10.15389/agrobiology.2023.3.483rus
УДК 635.112:631.522./524:577.2
Исследование выполнено в рамках государственного задания «Разработка технологий генотипирования сельскохозяйственных культур для ускорения и сопровождения селекционного процесса» (431-2022-0002).
ИССЛЕДОВАНИЕ МИКРОСАТЕЛЛИТНЫХ ЛОКУСОВ ГЕНОМА
САХАРНОЙ СВЕКЛЫ (Beta vulgaris L. ssp. vulgaris) ДЛЯ СОЗДАНИЯ
ТЕХНОЛОГИИ ГЕНЕТИЧЕСКОГО АНАЛИЗА ЛИНИЙ И ГИБРИДОВ
Т.В. ШАЛАЕВА1 ✉, Ю.В. АНИСКИНА1, О.С. КОЛОБОВА1,
Н.С. ВЕЛИШАЕВА 1, А.В. ЛОГВИНОВ2, В.Н. МИЩЕНКО2,
И.А. ШИЛОВ1
При промышленном семеноводстве сахарной свеклы (Beta vulgaris L. ssp. vulgaris) необходимо строго следить за поддержанием качества и размножением линий — компонентов гибридов. Одним из инструментов сопровождения этого процесса может быть метод микросателлитного анализа. Имеется множество сообщений о микросателлитных локусах в геноме сахарной свеклы. Однако для их использования в селекционной практике нужна высокопроизводительная и удобная в применении технология анализа. Для создания такой технологии, позволяющей получать стабильные ДНК-профили, требуется более детальное изучение геномных микросателлитных профилей на большой выборке верифицированного селекционного материала сахарной свеклы. В представленном исследовании впервые проведен детальный анализ первичной структуры ряда микросателлитных локусов генома сахарной свеклы с целью определения природы полиморфизма этих участков генома и их пригодности для получения устойчивых ДНК-профилей. Совместно с селекционерами (ФГБНУ Первомайская селекционно-опытная станция сахарной свеклы, г. Гулькевичи, Краснодарский край) нами была отобрана коллекция из 146 образцов сахарной свеклы (B. vulgaris), включающая 28 МС-линий, 28 линий О-типа, 82 линии-опылителя, 6 гибридов отечественной селекции (Азимут, Корвет, Первомайский, Рубин, Фрегат, Успех), гибриды Добрава и Доротея. Этот растительный материал был проанализирован по 12 микросателлитным локусам — FDSB 502, FBSB 1001, FDSB 1033, Unigene 27833, Unigene 26753, Unigene 16898, Unigene 17623B, Unigene 15915, Unigene 17923, SB 04, SB 09, SB 15. Аллельные варианты каждого локуса были амплифицированы, клонированы в плазмидный вектор pAL2-T и секвенированы. Результаты секвенирования аллелельных вариантов микросателлитных локусов FDSB 1001, FDSB 1033, Unigene 16898, Unigene 17623B, Unigene 26753, Unigene 17923, Unigene 27833, SB 04 подтвердили, что полиморфизм длин этих локусов обусловлен исключительно числом тандемных повторов в амплифицируемом фрагменте ДНК. Локус Unigene 15915 был исключен из дальнейшей работы, поскольку в нуклеотидных последовательностях его аллельных вариантов, помимо микросателлитных повторов (CА)n, были выявлены дополнительные инсерции и делеции. Полиморфизм аллельных вариантов микросателлитных локусов SB 09, SB 15 и FDSB 502 обусловлен сложными (составными) повторами. При этом локусы SB 09 и SB 15 были выбраны для дальнейшей работы, поскольку обеспечивали получение стабильных ДНК-профилей. По аллельным вариантам локуса FDSB 502 был выявлен полиморфизм (TC)n(GAT)n(AAG)n, что в ряде случаев может осложнять получение достоверных результатов генотипирования. Поэтому для использования локуса FDSB 502 при создании технологии генетического анализа линий и гибридов сахарной свеклы мы предлагаем использовать разработанные нами праймеры, фланкирующие только его вариабельные микросателлитные повторы (GAT)n и (AAG)n. Полученные в представленном исследовании результаты предполагается в дальнейшем использовать для создания технологии генетического анализа линий и гибридов сахарной свеклы. Такая технология может стать надежным лабораторным инструментом для сопровождения селекционного процесса и промышленного семеноводства сахарной свеклы.
Ключевые слова: Beta vulgaris, сахарная свекла, генотипирование, микросателлитный анализ, ДНК-профиль.
T.V. Shalaeva1 ✉, Yu.V. Aniskina1, O.S. Kolobova1, N.S. Velishaeva1,
A.V. Logvinov2, V.N. Mishchenko2, I.A. Shilov1
The quality control in the course of maintenance and reproduction of sugar beet (Beta vulgaris L. ssp. vulgaris) hybrid parent lines upon seed production is highly important. The method of microsatellite analysis seems to be very perspective tool to provide genotyping during breeding and seed production. Different research groups reported about microsatellite loci in the sugar beet genome. However, the implementation of this technique into the breeding process requires the development of robust and high-throughput technology of analysis. To develop a technology for obtaining stable DNA profiles, a more detailed study of the sugar beet genome microsatellite loci is required using a large set of verified breeding material. The sequencing a number of sugar beet genome regions containing microsatellite loci to clarify the nature of polymorphism as well as ability for providing the stable DNA profiles has been made in this study. Together with breeders (Pervomayskaya Selection and Experimental Station, Krasnodar Krai), a collection of 146 sugar beet plant samples was selected, including 28 male-sterile (MS) lines, 28 O-type lines, 82 pollinator lines, 6 hybrids of Russian selection (Azimut, Corvette, Pervomaisky, Rubin, Fregate, Uspekh) as well as Dobrava and Dorothea hybrids. Five plants of each sample were analyzed for 12 microsatellite loci, FDSB 502, FBSB 1001, FDSB 1033, Unigene 27833, Unigene 26753, Unigene 16898, Unigene 17623B, Unigene 15915, Unigene 17923, SB 04, SB 09, and SB 15. Allelic variants of each locus were amplified, cloned into the pAL2-T plasmid vector and sequenced. The results of sequencing the microsatellite loci FDSB 1001, FDSB 1033, Unigene 16898, Unigene 17623B, Unigene 26753, Unigene 17923, Unigene 27833, and SB 04 revealed that their length polymorphism is solely due to the different number of tandem repeats in the amplified DNA fragment. The locus Unigene 15915 was excluded from further work because of insertions and deletions in the flanking regions of microsatellite repeats (AC)n in its allelic variants. The polymorphism of allelic variants of the microsatellite loci SB 09, SB 15, and FDSB 502 is due to the complex (composite) repeats. Nevertheless, the SB 09 and SB 15 loci were approved for further study, since they produced stable DNA profiles. The allelic variants of the locus FDSB 502 contained the (TC)n(GAT)n(AAG)n sequence, which in some cases may complicate the analysis. To use this locus for the genetic analysis of sugar beet lines and hybrids, we propose the primers flanking only variable microsatellite repeatsб the (GAT)n and (AAG)n separately. The results we report here are prospective to develop a technology for the genetic analysis of sugar beet lines and hybrids as a reliable tool for both breeding and seed production.
Keywords: Beta vulgaris, sugar beet, fingerprinting, microsatellite analysis, DNA-profile.
1ФГБНУ Всероссийский НИИ сельскохозяйственной |
Поступила в редакцию |
