doi: 10.15389/agrobiology.2023.3.494rus
УДК 633.32:577.21
Финансирование исследований осуществлялось из средств федерального бюджета на выполнение государственного задания (проект № 0442-2019-0001АААА-А19-119122590053-0).
ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ПАСПОРТИЗАЦИЯ РОССИЙСКИХ СОРТОВ
КЛЕВЕРА ЛУГОВОГО (Тrifolium pratense L.) НА ОСНОВЕ
SSR- И SRAP-МАРКЕРОВ
И.А. КЛИМЕНКО✉, А.О. ШАМУСТАКИМОВА, В.А. ДУШКИН,
Ю.М. МАВЛЮТОВ, А.А. АНТОНОВ
Генетическая паспортизация — мощное дополнение к традиционным методам сортоиспытания и эффективный способ идентификации сортов сельскохозяйственных растений. В Российской Федерации, как и во всем мире, переходят к внедрению современных ДНК-технологий в селекционные программы, в систему регистрации сортов и коммерческого распространения семян, однако в работе с кормовыми травами преобладают подходы, основанные на фенотипической оценке. Это снижает эффективность отбора, увеличивает сроки и затраты на выведение новых сортов, их регистрацию и правовую защиту. В представленной работе впервые проведена оценка генетического полиморфизма коллекции российских и зарубежных сортов клевера лугового с помощью SSR- и SRAP-маркеров, выявлены сортоспецифичные ДНК-фрагменты для дифференциации изучаемого материала, уникальность которых подтверждена секвенированием. На основе полученных результатов для ряда российских сортов составлены эталонные генетические паспорта. Наша цель заключалась в разработке системы определения сортовой принадлежности и эталонных генетических паспортов на основе SSR- и SRAP-маркеров для российских сортов клевера лугового. Материалом служили семена 15 российских сортов клевера лугового (Trifolium pratense L.), полученные в ЦКП Биологические коллекции кормовых растений (ФНЦ ВИК им. В.Р. Вильямса) и 6 образцов зарубежной селекции из Коллекции генетических ресурсов Всероссийского института генетических ресурсов растений им. Н.И. Вавилова. Геномную ДНК выделяли из суммарной навески части растительной ткани 30 7-суточных проростков от каждого сорта. Использовали базовый SDS-метод с модификациями. Количественные и качественные показатели полученных ДНК-проб определяли посредством электрофореза в агарозном геле, измерения концентрации и оценки чистоты. Финальную концентрацию образов перед использованием в ПЦР доводили до 30 нг/мкл. Генотипирование выполняли с помощью 35 микросателлитных маркеров (база данных Red Clover Marker Database, http://marker.kazusa.or.jp/Red_clover) и 40 комбинаций праймеров к SRAP-мар-керам. При анализе 12 сортов клевера лугового с использованием 35 SSR-маркеров было получено 476 продуктов амплификации. Определены 8 пар микросателлитных (SSR) локуcов, идентифицирующих сорта в изучаемой выборке. Из 40 испытанных комбинаций праймеров, разработанных к SRAP-маркерам, выбрали 18 для анализа на расширенной коллекции из 16 российских и зарубежных сортов. С их использованием было выявлено 812 продуктов ПЦР, включая 85 полиморфных, что составило 10,5 %. Набор из 7 SRAP-маркеров можно использовать для определения сортовой принадлежности. Для верификации результатов уникальные для соответствующих сортов фрагменты ДНК были секвенированы. Аннотированные нуклеотидные последовательности, идентифицирующие сорта Трифон, Марс, Топаз, Атлант, Тетраплоидный ВИК, Метеор, ВИК 77, депонированы в международной базе генетических ресурсов GenBank NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/). На основе данных ДНК-фингерпринтинга составлены молекулярно-генетические формулы, отображающие аллельный состав микросателлитных локусов и полиморфизм интрон-экзонных участков генома, и разработаны 10 эталонных генетических паспортов для сортов клевера лугового российской селекции.
Ключевые слова: кормовые культуры, генетическое разнообразие, SSR-маркеры, SRAP-маркеры, ДНК-полиморфизм, генетическая паспортизация.
CERTIFICATION OF RUSSIAN RED CLOVER (Тrifolium pratense L.) VARIETIES BASED ON SSR AND SRAP MARKERS
I.A. Klimenko ✉, A.O. Shamustakimova, V.A. Dushkin, Yu.M. Mavlyutov, A.A. Antonov
Molecular-genetic certification is a powerful strategies and efficient addition to the traditional methods of variety testing and agricultural crops identification. Russia, as well as a world in a whole, introduces the current DNA technologies in the breeding programs, in a variety registration process and in a system of seed production. However, the traditional approaches, based on observation and recording the morphological characters, are the prevalent now for the forage crops. It influences negatively on efficiency of selection, increases the terms and coasts of the new varieties development, registration and breeders rights protection. In this paper, the results of creation a system for identification and genetic certification of Russian red clover cultivars on the base of SSR and SRAP-markers are submitted for the first time. The seeds of 15 domestic varieties from gene pool collection of Federal Williams Research Center of Forage Production and Agroecology and 6 accessions of foreign breeding from Vavilov All-Russian Institute of Plant Genetic Resources were used for investigations. The genome DNA was extracted from 7-day seedlings’ tissue. Bulk DNA samples were formed from 30 individual genotypes per each variety. We used basic SDS-method in own modifications. Quantity and quality of extracted DNA was analyzed by agarose gel electrophoresis and measurement of concentration and purity. The final concentration of DNA samples was 30 ng/ml. PCR amplification was performed using 35 SSR from the Red Clover Marker Database (http://marker.kazusa.or.jp/Red_clover), and 40 SRAP markers. A total of 476 PCR products were generated with SSR markers for 12 red clover varieties. A set of eight microsatellite loci was selected for identification the tested samples. With application of 40 SRAP markers, we selected 18 informative combinations for analysis of the red clover collection of 16 varieties. Total 812 PCR products were revealed and 85 (10.5 %) among them were determined as polymorphic. The set of 7 informative markers were identified for samples differentiation on the base of SRAP analysis. Unique varieties-specific DNA fragments were sequenced (Evrogen Lab company, Russia) for validation the results of analysis. Nucleotide sequences, identifying Russian red clover varieties Trifon, Mars, Topas, Atlant, Tetraploidniy VIK, Meteor, VIK 77, were included in the GenBank NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/). The data of DNA fingerprinting we used for development the molecular-genetic formulas representing microsatellite loci allele composition and polymorphism in exon and intron regions of genome. As a result of this study, 10 etalon genetic certificates were designed for Russian red clover varieties.
Keywords: forage crops, genetic diversity, SSR markers, SRAP markers, DNA polymorphism, genetic certification.
ФГБНУ ФНЦ кормопроизводства и агроэкологии |
Поступила в редакцию |
