doi: 10.15389/agrobiology.2023.3.554rus
УДК 633.18:575:57.085.23
ОЦЕНКА ЧАСТОТЫ ВНУТРИКАЛЛУСНОЙ ИЗМЕНЧИВОСТИ
АНДРОГЕННЫХ УДВОЕННЫХ ГАПЛОИДОВ РИСА (Oryza sativa L.)
ПО ГЕНАМ УСТОЙЧИВОСТИ К ПИРИКУЛЯРИОЗУ
М.В. ИЛЮШКО✉, М.В. РОМАШОВА, С.С. ГУЧЕНКО
Культивирование in vitro клеток и тканей сельскохозяйственных культур по назначению условно можно разделить на две группы: для получения генетически измененного исходного селекционного материала и для массового клонирования уже существующих форм и сортов. Андрогенез in vitro позволяет направить развитие микроспоры с гаметофитного пути на спорофитный с формированием удвоенных гаплоидов (doubled haploids, DHs) у диплоидных видов либо фиксацией дигаплоидов (полигаплоидов) у тетраплоидных видов, которые широко применяются в селекции растений. Вариабельность растений, полученных в культуре пыльников или микроспор с одного растения-донора, в большей степени изучена на геномном и хромосомном уровне, поскольку исследователей и селекционеров в первую очередь интересует спонтанное удвоение хромосом и, как следствие, полностью гомозиготное фертильное потомство. В настоящей работе впервые выявлена частота внутрикаллусной генетической изменчивости удвоенных гаплоидов риса Oryza sativa L., полученных в андрогенезе in vitro гибридных растений, с использованием генов устойчивости к пирикуляриозу семейства Pi (по двум и трем генам). Показано отсутствие значительного возрастания внутрикаллусной генетической изменчивости при увеличении числа детектированных генов. Мы изучили частоту возникновения внутрикаллусной изменчивости в андрогенезе in vitro у риса с целью определения степени генетической однородности удвоенных гаплоидов (DHs) от одного пыльника. Исследования проведены на удвоенных гаплоидах, полученных в андрогенезе in vitro у 13 гибридов F1 и одного гибрида F2 риса O. sativa. Выполнен молекулярно-генетический анализ 1271 растения (83 каллусных линии) на наличие аллелей устойчивости/восприимчивости следующих генов устойчивости риса к Pyricularia oryzae Cav. [Magnaporthe grisea (Hebert Barr.)]: Pi-z, Pi-b, Pi-1, Pi-2, Pi-ta. У удвоенных гаплоидов идентифицировали один-четыре гена в зависимости от наличия гетерозигот в исходных гибридах. При определении одного гена у DHs частота появления вариабельных каллусных линий составляет 24,0 %, по двум генам полиморфизм встречается среди 47,7 % каллусов, по трем генам полиморфны 62,5 % каллусных линий. У одной каллусной линии представлено не более четырех комбинации аллелей генов устойчивости к пирикуляриозу риса. Различия по частоте мономорфных каллусных линий, детектированных по одному, двум и трем генам, отсутствуют (χ2 = 0,21-0,95, р = 0,33-0,65). У одной каллусной линии с одинаковой комбинацией аллелей устойчивости двух генов сформировалось до 66 растений, с одинаковой комбинацией аллелей трех генов — до 18 растений. Зависимость полиморфизма от числа удвоенных гаплоидов на каллусной линии отсутствовала: коэффициент корреляции между числом аллелей одного гена и числом DHs — r = -0,14, между числом комбинаций аллелей по двум генам и DHs r = 0,25, между числом комбинаций аллелей по трем генам и DHs r = -0,35 (р < 0,05). Выявлена низкая внутрикаллусная генетическая изменчивость удвоенных гаплоидов риса в андрогенезе in vitro, обусловленная гаметоклональной вариабельностью. Таким образом, частота встречаемости полиморфных каллусных линий высокая, но с ограниченным набором комбинаций аллелей генов устойчивости риса к пирикуляриозу среди DHs. Существует истинное клонирование удвоенных гаплоидов риса в пределах каллусной линии в андрогенезе in vitro. Тем не менее из-за встречающегося полиморфизма DHs в пределах одного каллуса оправдан именно отбор линий удвоенных гаплоидов, принятый среди селекционеров. Выполненная работа актуальна для оптимизации селекционного процесса, включающего гаплоидную технологию.
Ключевые слова: Oryza sativa, удвоенные гаплоиды, частота внутрикаллусной генетической изменчивости, гены устойчивости к пирикуляриозу.
M.V. Ilyushko ✉, M.V. Romashova, S.S. Guchenko
In vitro culture of cells and tissues of agricultural crops can be conditionally divided into two groups, those to generate a genetically modified initial breeding material and those for mass cloning of existing forms and varieties. Androgenesis in vitro makes it possible to redirect the microspore development from the gametophytic to the sporophytic pathway with the formation of doubled haploids (DHs) in diploid species or the fixation of dihaploids (polyhaploids) in tetraploid species for their wide use in plant breeding. The variability of plants derived from anther or microspore cultures of one donor plant has been studied to a greater extent at the genomic and chromosomal level, since researchers and breeders are primarily interested in spontaneous chromosome duplication and, as a result, completely homozygous fertile offspring. In this work, for the first time, the frequency of intra-callus genetic variability for Pi family blast resistance genes (two and three genes) was estimated using rice (Oryza sativa L.) doubled haploids (DHs) obtained via androgenesis in vitro of hybrid plants. No significant increase in intra-callus genetic variability was shown with an increase in the number of detected genes. The intra-callus variability frequency in androgenesis in vitro in rice was studied in order to determine the genetic homogeneity degree of doubled haploids (DHs) from one anther. Studies were carried out on doubled haploids obtained in androgenesis in vitro of thirteen F1 hybrids and one F2 hybrid of rice O. sativa. Molecular genetic analysis of 1271 plants (83 callus lines) was performed to reveal resistance/susceptibility alleles of the genes Pi-z, Pi-b, Pi-1, Pi-2, Pi-ta for rice blast-resistance to Pyricularia oryzae Cav. [Magnaporthe grisea (Hebert Barr.)]. In doubled haploids, one to four blast-resistance genes were identified depending on the presence of heterozygotes in the original hybrids. When determining one gene in DHs, the frequency of variable callus lines accounted for 24.0 %. For two genes, polymorphism occurs among 47.7 % of calli. For three genes, 62.5 % of callus lines were polymorphic. No more than four combinations of rice blast resistance gene alleles are present in one callus line. There are no differences in the monomorphic callus lines frequency detected for one, two and three genes (χ2 = 0.21-0.95, p = 0.33-0.65). With the same combination of two resistance gene alleles, up to 66 plants were formed, and with the same combination of three genes alleles, up to 18 plants were produced per callus line. There was no dependence of polymorphism on the number of doubled haploids in the callus line. The correlation coefficients between the number of DHs and the number of alleles for one, two and three genes in the combination accounted for r = -0.14, r = 0.25, and r = -0.35 (р < 0.05). Genetic analysis of rice doubled haploids revealed a low intra-callus genetic variability during in vitro androgenesis due to gametoclonal variability. Thus, the polymorphic callus lines frequency is high, but with a limited set of allele combinations of rice blast resistance genes among DHs. There is true cloning of rice doubled haploids within the callus lineage in androgenesis in vitro. However, due to the DHs polymorphism within one callus, it is expedient to select lines of doubled haploids as breeders usually do. This work is relevant for optimizing the breeding process, including haploid technology.
Keywords: Oryza sativa, doubled haploids, intra-callus genetic variability frequency, blast resistance genes.
ФГБНУ ФНЦ агробиотехнологий Дальнего Востока |
Поступила в редакцию |
