doi: 10.15389/agrobiology.2023.3.416rus
УДК 632.7:579.64
Работа выполнена при поддержке Минобрнауки России в рамках соглашения № 075-15-2021-1055 от «28» сентября 2021 г. о предоставлении гранта в форме субсидии из федерального бюджета на реализацию проекта: «Мобилизация генетических ресурсов микроорганизмов на базе Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения (ВКСМ) при ФГБНУ ВНИИСХМ с использованием сетевого принципа организации».
МОДИФИЦИРОВАННАЯ ПОЛУСИНТЕТИЧЕСКАЯ СРЕДА MMBt ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ПРЕПАРАТОВ НА ОСНОВЕ Bacillus thuringiensis
С.Д. ГРИШЕЧКИНА1 ✉, Т.К. КОВАЛЕНКО2, Т.В. КИРПИЧЕВА3,
К.С. АНТОНЕЦ1, А.А. НИЖНИКОВ1
Одно из направлений в биологической борьбе с вредными организмами — использование бактерий рода Bacillus, в том числе энтомопатогенных штаммов Bacillus thuringiensis. Для производства препаратов на основе B. thuringiensis разработаны питательные среды, в состав которых входят натуральные органические компоненты. В настоящей работе впервые подобрана и модифицирована оптимальная полусинтетическая среда MMBt, позволяющая улучшить технологический процесс, который обеспечивает получение эффективных и технологичных биопрепаратов на основе различных сероваров Bacillus thuringiensis. Цель работы — поиск оптимальных сред для получения эффективных и технологичных в производстве и применении биопрепаратов на основе Bacillus thuringiensis. Объектами исследования служили культуры B. thuringiensis var. thuringiensis 800/15 (BtH1 800/15) и B. thuringiensis var. darmstadiensis 25 (BtH10 25). Состав сред для культивирования был следующим: среда ССY — 0,5 мМ MgCl2·6H2O, 0,01 мМ MnCl2·4H2O, 0,05 мМ FeCl3·6H2O, 0,05 мМ ZnCl2, 0,2 мМ CaCl2·6H2O, 13 мМ KH2PO4, 26 мМ K2HPO4, 20 мг/л глутамина, 1 г/л гидролизата казеина, 0,4 г/л дрожжевого экстракта, 0,6 г/л глицерола; среда MВt — 7 г/л гидролизата казеина, 6,8 г/л KH2PO4, 0,12 г/л MgSO4·7H2O, 0,0022 г/л MnSO4·4H2O, 0,014 г/л ZnSO4·7H2O, 0,02 г/л Fe2(SO4)3, 0,18 г/л CaCl2·4H2O; среда LВ — 10 г/л триптона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 10 г/л NaCl; модифицированная полусинтетическая среда MMBt (modified MBt) — 7 г/л гидролизата казеина, 6,8 г/л KH2PO4, 0,12 г/л MgSO4·7H2O, 0,0022 г/л MnSO4·4H2O, 0,014 г/л ZnSO4·7H2O, 0,02 г/л Fe2(SO4)3, 0,18 г/л CaCl2·4H2O (25) + глюкоза (1,0 %) и цитрат Na (2 г/л). Эталоном служили дрожже-полисахаридные среды (ДПС) для BtH1 и BtH10. Штаммы Bt культивировали в колбах Эрленмейера объемом 750 мл, заполненных 40-50 мл среды, на качалке при 220 об/мин и температуре 29 °C в течение 48-72 ч до созревания культуры, сопровождающегося образованием спор и кристаллического эндотоксина. На основе штаммов ВtH1 800/15 и ВtH10 25 были получены партии жидких препаратов, эффективность которых оценивали в 2020 и 2021 годах на картофеле (Solanum tuberosum L.) сорта Янтарь на Дальнем Востоке (Приморский край, Уссурийский р-н) против Henoseplachna vigintioctomaculata Motsch и на картофеле сорта Емеля в Тамбовской области против Leptinotarsa decemleniata Say. В опытах использовали жидкие препараты, полученные на ДПС и MMBt. В контроле обработки не проводили, химическим эталоном против колорадского жука служил препарат Борей (АО «Август», Россия; норма расхода 0,1 л/га). Учеты проводили на 5-е, 10-е и 15-е сут после обработки. Нормы применения жидких препаратов против колорадского жука — 20 л/га; против картофельной коровки — 15 и 20 л/га. Биологическую эффективность препаратов рассчитывали по формуле W.S. Abbot. Антифунгальную активность препарата ВtH10 25, полученного на MMBt и ДПС, определяли методом агаровых блоков in vitro в чашках Петри. В контроле использовали среду без добавления препаратов. Тест-культурами служили грибы Botrytis cinerea Pers. (штамм С-5) и Bipolaris sorokiniana (Sacc.) Shoemaker (штамм С-20). Ингибирующую активность рассчитывали по формуле W.S. Abbot. Культивирование штаммов BtH1 800/15 и BtH10 25 на разных питательных средах показало, что на полусинтетических средах MВt и LВ титры КОЕ были в 2 раза ниже, чем на ДПС, а на среде ССY — в 10 раз ниже. Их активность, определенная по содержанию экзотоксина, также была ниже, но на среде MВt у BtH1 800/15 она незначительно уступала ДПС. Поэтому для дальнейших исследований мы выбрали среду MВt, которая в результате проведенных экспериментов по оптимизации состава была модифицирована посредством добавления глюкозы (1,0 %) и цитрата Na (2 г/л). Полученная среда (MMBt) позволила добиться существенного повышения титров, активности и скорости развития культуры по сравнению с исходной MBt. В 2020 году в Тамбовской области эффективность препарата на основе BtH1 800/15 против колорадского жука была высокой и на 5-е сут у препарата, полученного на ДПС, составляла 95,3 %, незначительно уступая химическому эталону. У препарата, полученного на MMBt, она была несколько ниже (83,3 %), но защитное действие сохранялось дольше, и на 15-е сут эффективность составляла 73,7 %. В 2021 году эффективность препарата BtH1 800/15 была ниже, чем в 2020 году. У препарата, наработанного на MMBt, она немногим уступала эффективности препарата, полученного на ДПС, составив на 5-е сут после обработки соответственно 75,3 и 67,7 %. Действие препарата ВtH10 25, полученного на MMBt, было слабее, чем в варианте с ВtH1 800/15 (47,7 % на 5-е сут). В Приморском крае также была отмечена высокая эффективность жидких препаратов против H. vigintioctomaculata. В 2020 году при норме применения препарата BtH1 800/15 15 л/га эффективность в вариантах ДПС и MMBt составляла на 5-е сут соответственно 60,5 и 63,9 %. Аналогичные данные были получены в 2021 году. Ингибирующая активность препарата ВtH10 25, полученного на MMBt, на 5-е сут была на 12 % выше, чем у препарата, наработанного на ДПС, и составляла для B. sorokiniana 72,3 и 60,8 %, для B. cinerea — 78,9 и 67,4 %. На 10-е сут эта тенденция сохранялась, но для препарата, наработанного на ДПС, было отмечено снижение ингибирования роста колоний B. sorokiniana и B. cinereaсоответственно до 57,3 и 44,3 %. Таким образом, препараты на основе Bacillus thuringiensis, полученные на среде MMBt, по эффективности в отношении вредителей лишь незначительно уступали препаратам, полученным на ДПС, а в отношении фитопатогенов их эффективность была выше, чем у препаратов с ДПС. Среда MMBt перспективна для агробиотехнологии, поскольку при ее использовании за счет увеличения скорости роста культуры B. thuringiensis сокращается время, необходимое для формирования спор и белкового кристаллического эндотоксина. Так, на среде MMBt этот процесс заканчивается через 48 ч, а на среде ДПС через 72 ч, что позволяет уменьшить энергозатраты.
Ключевые слова: биопрепарат, Bacillus thuringiensis var. thuringiensis, Bacillus thuringiensis var. darmstadiensis, Bipolaris sorokiniana, Botrytis cinerea, колорадский жук, кар-тофельная коровка, ингибирующая активность, культуральная среда.
MODIFIED SEMISYNTHETIC MEDIUM MMBt FOR PRODUCTION OF PREPARATIONS BASED ON Bacillus thuringiensis
S.D. Grishechkina1 ✉, T.K. Kovalenko2, T.V. Kirpicheva3,
K.S. Antonets1, A.A. Nizhnikov1
One of the trends in the biological control of pests is the use of bacteria belonging to the genus Bacillus and, first of all, entomopathogenic strains of Bacillus thuringiensis. Of great interest to industrial biotechnology are studies related to the search for optimal cultivation conditions that can improve the manufacturability of the production of microbiological preparations and their effectiveness. Previously, the nutrient media for the production of microbiological preparations based on B. thuringiensiswhich include natural organic components have been developed. Nevertheless, during the production of biopreparations based on this bacterium, the foaming of the culture frequently occurs and expensive filters of bioreactors have to be replaced. Also, during the treatment of plants, working solutions containing organic components of the liquid medium can clog the nozzles. This effect complicates the treatment process. In addition, organic cultural media components are not standard and depend on the quality and source origin. In this regard, it is important to carry out the screening of optimal synthetic media that could eliminate these shortcomings. Our study was aimed at selecting the optimal synthetic media and evaluating the effectiveness of the obtained preparation samples in laboratory and field conditions. The objects of study were the cultures of B. thuringiensis var. thuringiensis 800/15 (BtH1 800/15) and B. thuringiensis var. darmstadiensis 25 (BtH10 25). The composition of the culture media was as follows: CCY medium — 0.5 mM MgCl2·6H2O, 0.01 mM MnCl2·4H2O, 0.05mM FeCl3·6H2O, 0.05 mM ZnCl2, 0.2 mM CaCl2·6H2O, 13 mM KH2PO4, 26 mM K2HPO4, 20 mg /l glutamine, 1 g/l casein hydrolysate, 0.4 g/l yeast extract, 0.6 g/l glycerol; MBt medium: 7 g/l casein hydrolyzate, 6.8 g/l KH2PO4, 0.12 g/l MgSO4·7H2O, 0.0022 g/l MnSO4·4H2O, 0.014 g/l ZnSO4·7H2O, 0.02 g/l Fe2(SO4)3, 0.18 g/l CaCl2·4H2O; LB medium: 10 g/l trypton, 5 g/l yeast extract, 10 g/l NaCl; modified semi-synthetic medium MMBt (modified MBt): 7 g/l casein hydrolyzate, 6.8 g/l KH2PO4, 0.12 g/l MgSO4·7H2O, 0.0022 g/l MnSO4·4H2O, 0.014 g/l ZnSO4·7H2O, 0.02 g/l Fe2(SO4)3, 0.18 g/l CaCl2·4H2O (25), glucose (1.0 %), Na citrate (2 g/l). Yeast polysaccharide media (YPM) for BtH1 and BtH10 served as a reference. Bt strains were cultivated in 750 ml Erlenmeyer flasks filled with 40-50 ml of medium on a shaker at 220 rpm and 29 °C for 48-72 h until the maturation of culture, accompanied by the formation of spores and crystalline endotoxin. On the basis of BtH1 800/15 and BtH10 25 strains, batches of liquid preparations were obtained, the effectiveness of which was evaluated in 2020 and 2021 on potatoes (Solanum tuberosum L.) of the Yantar variety in the Far East (Ussuri district of Primorsky Krai) against Henoseplachna vigintioctomaculata Motsch and on potatoes of the Emelya variety in the Tambov region against Leptinotarsa decemleniata Say. In the experiments, liquid preparations obtained on YPM and MMBt were used, which were used at consumption rates of 15 and 20 l/ha. The biological effectiveness of the preparations was calculated according to the formula W.S. Abbot. The antifungal activity of the preparation BtH10 25, obtained on MMBt and YPM, was determined by the method of agar blocks in vitro in Petri dishes. The control medium was used without the addition of drugs. Fungi Botrytis cinerea Pers (strain C-5) and Bipolaris sorokiniana (Sacc.) Shoemaker (strain C-20) served as test cultures. The inhibitory activity was calculated according to the W.S. Abbot. Cultivation of BtH1 800/15 and BtH10 25 strains on different nutrient media showed that on semi-synthetic media MBt and LB CFU titers were 2 times lower than on YPM, while on CCY medium they were 10 times lower. Their activity, determined by the content of exotoxin, was also lower, but on the MBt medium it was slightly inferior to YPM for BtH1 800/15. Therefore, MBt medium was chosen for further studies, and the composition of this medium was modified by adding glucose (1.0 %) and Na citrate (2 g/l). The resulting MMBt medium made it possible to achieve a significant increase in titers, activity, and the rate of culture development compared to the initial MBt. In 2020 in the Tambov region, the effectiveness of the preparation based on BtH1 800/15 obtained on DPS was high against the Colorado potato beetle and on the 5th day was 95.3 %, slightly inferior to the chemical standard. In the case of preparation obtained on MMBt, it was slightly lower (83.3 %), but the protective effect lasted longer, and on day 15 the efficiency was 73.7 %. In 2021, the efficacy of BtH1 800/15 was lower than in 2020. In the preparation obtained on MMBt, it was slightly inferior to the effectiveness of the preparation obtained on YPM, amounting to 75.3 and 67.7 %, respectively, on the 5th day after treatment. The effect of the BtH10 25 preparation obtained on MMBt was weaker than in the variant with BtH1 800/15 (47.7 % on day 5). In Primorsky Krai, the high efficacy of liquid preparations against H. vigintioctomaculata was also noted. In 2020, at a rate of application of the BtH1 800/15 preparation of 15 l/ha, the effectiveness in the YPM and MMBt variants was 60.5 and 63.9 %, respectively, on day 5. Similar data was obtained in 2021. The inhibitory activity of the BtH10 25 preparation obtained on MMBt was 12 % higher on day 5 than that of the preparation obtained on YPM, and was 72.3 and 60.8 % for B. sorokiniana and 78.9 and 67.4% for B. cinerea. On day 10, this trend persisted, but for the preparation produced on YPM, a decrease in the inhibition of the growth of B. sorokiniana and B. cinerea colonies, respectively, to 57.3 and 44.3% was noted. Thus, preparations based on Bacillus thuringiensis obtained on the MMBt medium were only slightly inferior in terms of effectiveness against pests to preparations obtained on YPM, while their effectiveness against phytopathogens was higher than that of preparations with YPM. The MMBtmedium is promising for agricultural biotechnology, since its use reduces the time required for the formation of spores and crystalline protein endotoxin by increasing the growth rate of the B.thuringiensis culture. Thus, on the MMBt medium, this process ends after 48 h, and on the YPM medium, after 72 h, which makes it possible to reduce energy consumption.
Keywords: biopreparation, Bacillus thuringiensis var. thuringiensis, Bacillus thuringiensis var. darmstadiensis, Bipolaris sorokiniana, Botrytis cinerea, Colorado potato beetle, potato ladybug, inhibitory activity, cultural medium.
1ФГБНУ Всероссийский НИИ сельскохозяйственной |
Поступила в редакцию |
