doi: 10.15389/agrobiology.2025.6.rus
УДК 619:578.2:577.2
Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда № 24-76-10044, https://rscf.ru/project/24-76-10044».
ПОЛУЧЕНИЕ КАНДИДАТНОГО ВАКЦИННОГО ШТАММА ВИРУСА
ВЫСОКОПАТОГЕННОГО ГРИППА ПТИЦ ПОДТИПА A(H5N1)
МЕТОДОМ ОБРАТНОЙ ГЕНЕТИКИ
М.В. СЕРГЕЕВА1, К.С. КУДРЯ1, М.А. ПЛОТНИКОВА1,
В.В. ВЕРЕТЕННИКОВ2, Э.Д. ДЖАВАДОВ2, Д.А. КРАСКОВ2,
А.А. ИВАНОВА1, П.А. ПЕТРОВА1, Н.В. ТАРЛАВИН2✉
Высокопатогенный вирус гриппа птиц подтипа H5N1 активно циркулирует среди домашней и дикой птицы по всему миру и становится причиной массовой гибели домашних птиц. Основные способы борьбы против гриппа птиц — уничтожение поголовья птиц и вакцинация. Указанные меры позволили установить контроль за распространением вируса гриппа подтипа H5N1, обеспечить снижение числа новых вспышек данного заболевания и вирусной нагрузки на окружающую среду. Среди современных технологий создания вакцин против вирусов гриппа А получил распространение метод обратной генетики. В настоящей работе впервые описано создание рекомбинантного штамма вируса гриппа подтипа H5N1 клайда 2.3.4.4b с модифицированным гемагглютинином антигенно актуального вируса, выделенного на территории России в 2023 году. Мы показали, что сконструированный штамм обладает высокими производственными характеристиками в системе РКЭ (развивающиеся куриные эмбрионы) и в клеточной культуре MDCK. Также мы впервые применили его в составе вакцины с добавлением гидроксида алюминия в качестве адъюванта для иммунизации целевых животных и установили, что вакцинация стимулирует выработку антител у цыплят 1-суточного возраста. Нашей целью было конструирование методом обратной генетики вакцинного штамма-кандидата, который может быть использован для создания ветеринарной вакцины против современных вирусов высокопатогенного гриппа птиц подтипа H5N1. Работу проводили в 2024 году в ФГБУ НИИ гриппа им. А.А. Смородинцева Минздрава России. Источником РНК служил лизированный образец, содержащий генетический материал вируса А/черноголовая чайка/Сыктывкар/19987/2023 (H5N1). Амплифицикацию полноразмерных кДНК копий вирусных генных сегментов HA и NA осуществляли с использованием набора универсальных пар праймеров. Полимеразную цепную реакцию с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) проводили с использованием набора ОТ-ПЦР Экстра микс (ООО «Биолабмикс», Россия) на приборе Gentier 96E («Xi'an Tianlong Science and Technology, Co., Ltd.», Китай). Полученные продукты клонировали в вектор pHW2000, предназначенный для сборки вирусов гриппа методом обратной генетики. Плазмидами трансформировали бактериальные клетки Escherichia coli DH5-a. Нуклеотидную последовательность отобранных клонов верифицировали методом секвенирования по Сэнгеру (ЗАО «Евроген», Россия). Для модификации сайта расщепления НА осуществляли поиск нуклеотидных последовательностей близкородственных низкопатогенных вирусов гриппа A/H5N1 клайда 2.3.4.4b с использованием базы данных EpiFlu («GISAID», Германия). Нуклеотидные последовательности сайтов расщепления выбранных низкопатогенных вирусов использовали для модификации плазмиды, кодирующей ген НА методом сайт-направленного мутагенеза (ЗАО «Евроген», Россия). Для сборки рекомбинантного вируса методом обратной генетики использовали смесь плазмид на основе вектора pHW2000: модифицированный НА и NA подтипа H5N1 (описаны выше), а также плазмиды, кодирующие гены внутренних и неструктурных белков (PB2, PB1, PA, NP, M, NS) высокорепродуктивного штамма-донора A/PR/8/34 (H1N1). Смесь плазмид трансфецировали в ко-культуру клеток НЕК293FТ/MDCK, выращенных в среде DMEM/F12. Для трансфекции использовали липосомы GenJect39 (ООО «Молекта», Россия). Через 1 сут проводили смену среды на бессыворочную с TPCK-трипсином («Sigma», США). Далее каждые сутки проверяли наличие цитопатического действия (ЦПД) вируса визуально в световой микроскоп AxioVert A1 («Carl Zeiss AG», Германия), а также контролировали появление вируса в культуральной среде с помощью реакции гемагглютинации (РГА). Для накопления вируса 10-11-суточные РКЭ заражали вируссодержащим материалом в различных разведениях в объеме 0,2 мл в аллантоисную полость. Для определения инфекционной активности в системе РКЭ из вируссодержащей жидкости готовили серии 10-кратных разведений на DPBS (ООО «БиолоТ», Россия) с добавлением антибиотика-антимикотика. Расчет 50 % эмбриональной инфекционной дозы (ЭИД50) проводили по методу L.J. Reed и H. Muench и выражали в lg ЭИД50/мл. Полногеномные нуклеотидные последовательности вируса получали методом секвенирования нового поколения по технологии «Illumina, Inc.» (США). Характерный для низкопатогенных вирусов гриппа птиц фенотип подтверждали по отсутствию репродукции в пермиссивной культуре клеток MDCK в отсутствие эндогенной трипсиноподобной протеазы. Антигенные свойства вируса изучали в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) со специфическими крысиными антисыворотками, полученными к вирусам гриппа А подтипа Н5 различных лет выделения, и соответствующими вирусами из коллекции ФГБУ НИИ гриппа им. А.А. Смородинцева МЗ РФ. Способность штамма вызывать формирование вирус-специфических антител оценивали на 1-суточных цыплятах кросса Декалб Уайт. Методом обратной генетики был собран рекомбинантный вакцинный штамм A/Syktyvkar/PR8/6:2/HA20 (H5N1), представляющий собой реассортант с составом генома 6:2, на основе высокорепродуктивного донора A/PR/8/34 с поверхностными антигенами высокопатогенного вируса гриппа птиц подтипа H5N1. Штамм охарактеризован и депонирован в Государственной коллекции вирусов. Для оценки штамма был проведен антигенный анализ с антисыворотками, полученными к вирусам гриппа подтипа H5N1 различных клайдов, циркулировавших на территории России в период 2000-2025 годов. Анализ показал, что разработанный штамм не взаимодействует с антисыворотками клайдов 1 и 2.2, а с антисывороткой клайда 2.3.4.4b взаимодействие было ниже, чем с гомологичной сывороткой. При оценке стабильности разработанного вакцинного штамма отмечена высокая репродукция вируса в системе РКЭ в течение 5 последовательных пассажей. Методом секвенирования было исключено появление в геноме вируса дополнительных мутаций. С разработанным штаммом была сконструирована инактивированная вакцина с добавлением гидроокиси алюминия в качестве сорбентного адъюванта в конечной концентрации 0,2 %. Опыт на цыплятах кросса Декалб Уайт показал пригодность использования разработанного штамма в качестве антигена в составе вакцины. При введении вакцины цыплятам в 1-суточном возрасте в объеме 0,5 мл/гол. (прививная доза составляла 8,4 lg/гол.) титр антител спустя 28 сут составил 1:388 в РТГА. Этот титр антител существенно превышает требуемый для стойкой и продолжительной защиты (1:32 в РТГА). Таким образом, полученный рекомбинантный штамм вируса гриппа A/Syktyvkar/PR8/6:2/HA20 (H5N1) полностью подходит для производства биопрепаратов для ветеринарного применения, в том числе инактивированных вакцин.
Ключевые слова: высокопатогенный грипп птиц, вакцина, рекомбинатнтные вакцины, обратная генетика, инфекционные болезни птиц, конструирование плазмид, вирус гриппа А подтипа H5N1.
M.V. Sergeeva1, K.S. Kudrya1, M.A. Plotnikova1,
V.V. Veretennikov2, E.D. Javadov2, D.A. Kraskov2,
A.A. Ivanova1, P.A. Petrova1, N.V. Tarlavin2✉
The highly pathogenic avian influenza virus subtype H5N1 actively circulates among domestic and wild poultry worldwide, causing widespread mortality. The primary methods of combating avian influenza include culling and vaccination. These measures have enabled control of the spread of the H5N1 influenza virus, reducing the number of new outbreaks and the viral load on the environment. Reverse genetics has become a widely used modern technology for creating vaccines against influenza A viruses. This study describes for the first time the creation of a recombinant strain of the H5N1 influenza virus subtype 2.3.4.4b with a modified hemagglutinin of an antigenically relevant virus isolated in Russia in 2023. We demonstrated that the constructed strain exhibits high production characteristics in the ECE (developing chicken embryos) system and in MDCK cell culture. We also used it for the first time in a vaccine with the addition of aluminum hydroxide as an adjuvant for immunization of target animals and found that vaccination stimulates antibody production in 1-day-old chickens. Our goal was to construct a candidate vaccine strain using reverse genetics that could be used to create a veterinary vaccine against modern highly pathogenic avian influenza viruses of the H5N1 subtype. The work was carried out in 2024 at the Smorodintsev Research Institute of Influenza of the Ministry of Health of the Russian Federation. The RNA source was a lysed sample containing the genetic material of the A/black-headed gull/Syktyvkar/19987/2023 (H5N1) virus. Amplification of full-length cDNA copies of the HA and NA viral gene segments was carried out using a set of universal primer pairs. Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) was performed using the Extra Mix RT-PCR kit (Biolabmix LLC, Russia) and a Gentier 96E instrument (Xi'an Tianlong Science and Technology, Co., Ltd., China). The resulting products were cloned into the pHW2000 vector, designed for assembling influenza viruses by reverse genetics. Escherichia coli DH5-α bacterial cells were transformed with plasmids. The nucleotide sequence of the selected clones was verified by Sanger sequencing (Eurogen CJSC, Russia). To modify the HA cleavage site, a search for nucleotide sequences of closely related low-pathogenic influenza A/H5N1 viruses of clade 2.3.4.4b was performed using the EpiFlu database (GISAID, Germany). The nucleotide sequences of the cleavage sites of the selected low-pathogenicity viruses were used to modify the plasmid encoding the HA gene by site-directed mutagenesis (Eurogen, Russia). To assemble the recombinant virus by reverse genetics, a mixture of plasmids based on the pHW2000 vector was used: modified HA and NA of the H5N1 subtype (described above), as well as plasmids encoding the genes of internal and nonstructural proteins (PB2, PB1, PA, NP, M, NS) of the highly reproductive donor strain A/PR/8/34 (H1N1). The plasmid mixture was transfected into a coculture of HEK293FT/MDCK cells grown in DMEM/F12 medium. GenJect39 liposomes (Molecta, Russia) were used for transfection. In 1 day, the medium was changed to a serum-free medium with TPCK-trypsin (Sigma, USA). Then, every day, the presence of cytopathic effect (CPE) of the virus was checked visually using an AxioVert A1 light microscope (Carl Zeiss AG, Germany), and the appearance of the virus in the culture medium was monitored using the hemagglutination assay (HA). To accumulate the virus, 10- to 11-day-old ECEs were infected with virus-containing material in various dilutions in a volume of 0.2 ml into the allantoic cavity. To determine the infectious activity in the ECE system, a series of 10-fold dilutions were prepared from the virus-containing fluid in DPBS (OOO BioloT, Russia) added with an antibiotic-antimycotic. Calculation of 50 % embryonic infectious dose (EID50) was performed according to the method of L.J. Reed and H. Muench and expressed as lg EID50/ml. Whole-genome nucleotide sequences of the virus were obtained by next-generation sequencing using Illumina, Inc. (USA). The phenotype characteristic of low-pathogenic avian influenza viruses was confirmed by the absence of replication in a permissive MDCK cell culture lacking endogenous trypsin-like protease. The antigenic properties of the virus were studied in a hemagglutination inhibition assay (HI assay) with specific rat antisera to influenza A H5 subtype viruses of various years of isolation and corresponding viruses from the collection of the Smorodintsev Research Institute of Influenza. The ability of the strain to induce the formation of virus-specific antibodies was assessed in 10-day-old Dekalb White chickens. A recombinant vaccine strain A/Syktyvkar/PR8/6:2/HA20 (H5N1), a reassortant with a 6:2 genome composition, was assembled using reverse genetics, based on the highly reproductive donor A/PR/8/34 with surface antigens of the highly pathogenic avian influenza virus subtype H5N1. The strain was deposited to the State Collection of Viruses. To evaluate the strain, an antigen analysis was performed with antisera obtained to influenza viruses of the H5N1 subtype of various clades circulating in Russia between 2000 and 2025. The analysis showed that the constructed strain does not interact with antisera to clades 1 and 2.2, and the interaction with the antiserum to clades 2.3.4.4b was lower than with the homologous serum. When assessing the stability of the developed vaccine strain, high virus reproduction in the ECE system was noted over 5 consecutive passages. The appearance of additional mutations in the viral genome was excluded by the sequencing method. An inactivated vaccine was constructed using the developed strain with the addition of aluminum hydroxide as a sorbent adjuvant at a final concentration of 0.2 %. A trial on Dekalb White chickens demonstrated the suitability of the developed strain as an antigen in a vaccine. When the vaccine was administered to 1-day-old chickens at a dose of 0.5 ml/head (the vaccination dose was 8.4 lg/head), the antibody titer after 28 days was 1:388 in the HI assay. This antibody titer significantly exceeds that required for stable and long-term protection (1:32 in the HI assay). Thus, the resulting recombinant influenza virus strain A/Syktyvkar/PR8/6:2/HA20 (H5N1) is fully suitable for the production of biopreparations for veterinary use, including inactivated vaccines.
Keywords: highly pathogenic avian influenza, vaccine, recombinant vaccines, reverse genetics, avian infectious diseases, plasmid construction, influenza A virus of the H5N1 subtype.
1ФГБУ НИИ гриппа им. А.А. Смородинцева |
Поступила в редакцию Принята к публикации |
