СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ, 2008, № 3, с. 88-95

УДК 634.8:631.095.337

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПОТРЕБНОСТИ В СОДЕРЖАНИИ МИНЕРАЛЬНЫХ ЭЛЕМЕНТОВ В ПОЧВЕ У ГЕНОТИПОВ ВИНОГРАДА ПО СПОСОБНОСТИ РАСТЕНИЙ ОБРАЗОВЫВАТЬ КОРНЕВЫЕ ВОЛОСКИ in vitro

В.А. Зленко, И.В. Котиков, Л.П. Трошин

Изучали образование корневых волосков у растений Vitis solonis, двух подвоев и пяти корнесобственных сортов винограда в жидких средах с разным содержанием KNO3 и CaCl2 на фоне низких концентраций других соединений и в зависимости от изменения содержания MgSO4 и KH2PO4, а также при внесении в среду культивирования стимуляторов роста и витаминов (b-индолилуксусная, феруловая и никотиновая кислоты, м-инозит). Показаны преимущества определения потребности генотипов в минеральных веществах по способности образовывать корневые волоски in vitro по сравнению с оценкой по признакам развития растений.

Ключевые слова: Vitis, in vitro, диагностика признака, минеральный элемент, корневые волоски, минеральное питание растения.

Key words: Vitis, in vitro, diagnostics of parameters, mineral element, rootstocks, mineral nutrition of plant.

Известно, что из минеральных элементов главное влияние на рост и продуктивность растений винограда оказывают Mg, Ca, N, P и К. При возделывании винограда почвы безвозвратно теряют азот, фосфор и калий, поэтому для поддержания и повышения плодородия требуется системное внесение азотных, фосфорных и калийных удобрений в оптимальных для нормального развития растений дозах (1). В то же время завышенным содержанием азотных удобрений, например, обусловлено усиление развития серой гнили (2), помутнение виноматериалов (1), при сильном росте побегов слабо развивается корневая система, лоза плохо вызревает и чаще гибнет при перезимовке (3). Избыток азота или фосфора может привести к недостаточности калия, а избыток калия обусловливает недостаточность магния (4). J. Fraguas предложил методику определения необходимых доз удобрений по оценке содержания N, Р, K, Са и Mg в листьях винограда и почве с введением дополнительных коэффициентов, отражающих потребность растений разных генотипов в каждом из минеральных элементов (5). Кроме того, что генотипы винограда характеризуются неодинаковой способностью поглощать ионы из почвы, разным подвоям и сортам винограда для оптимального роста требуется определенное содержание ионов в растении (6). При этом от подвоя может зависеть содержание минеральных веществ в побегах привоя (7) и ответная реакция сорта на внесение разных доз удобрения в почву (рост, урожай, качество) (8, 9).
Для изучения поглощения минеральных элементов растениями винограда разных генотипов создают контролируемые условия в гидропонной культуре (4, 6, 10). По сравнению с гидропонной культурой, преимущество методов in vitroдля изучения минерального питания растений в том, что при меньших затратах они позволяют изучать большее число генотипов в строго контролируемых условиях в любой сезон года за меньшие промежутки времени (1-2 мес для травянистых или древесных видов растений). Показано, что развитие растений in vitro коррелирует с видовой и сортовой специфичностью роста в полевых условиях (11). Сорта винограда различаются по потребности в минеральных веществах для развития растений in vitro, в том числе для корнеобразования (12).
Цель наших исследований заключалась в изучении возможности оценивать оптимальное содержание минеральных элементов в почве для разных генотипов винограда по их способности образовывать корневые волоски при культивировании in vitro на мостиках из фильтровальной бумаги в жидких средах с заданными концентрациями макроэлементов. В этой связи задачами эксперимента было выявить различия по оптимальным концентрациям соединений — источников макроэлементов (KNO3, CaCl2, MgSO4 и КН2РO4), которые необходимы для полноценного развития и образования корневых волосков, влияние изменения концентрации одних соединений (MgSO4 и КН2РO4) на изменение потребности в других (KNO3 и CaCl2), а также определить эффект биологически активных веществ — м-инозита, b-индолилуксусной (ИУК), феруловой и никотиновой кислот в зависимости от концентрации макроэлементов в жидких средах.
Методика. Опыты проводили на растениях вида Vitis solonis Planch. и межвидовых гибридов ― подвоях Riparia ½ Rupestris Кобер 5ББ (далее — Кобер 5ББ) и Феркаль, на сортах, полученных в результате скрещиваний между V. vinifera L. и франко-американскими гибридами (Филлоксероустойчивый Джемете, Антей магарачский, Юбилейный Магарача, Подарок Магарача), а также на гибриде V. vinifera L. и V. rotundifolia Michx. — сорте Интервитис Магарача [(Катта-Курган ½ Шабаш крупноягодный) ½ DRX 100-74-1-5].
Выращивание в культуре in vitroвыполняли по методике П.Я. Голодриги и др. (13). В жидких средах рH доводили до 5,0-5,2 NaOH перед автоклавированием (25 мин при 1 атм под крышками из алюминиевой фольги). Для получения эксплантов растения культивировали при температуре 27 °С и освещенности 3000 лк (белые люминесцентные лампы) с 16-часовым фотопериодом в течение 2 мес. После этого растения разрезали на черенки с одним листом (верхушки и нижние черенки не использовали) и высаживали экспланты на мостики из фильтровальной бумаги в пробирки размером 22½200 мм со стерильной жидкой средой (7 мл на пробирку) таким образом, чтобы нижний срез черенка прикасался к фильтровальной бумаге в желобке мостика.
Для оценки потребности в макро-, микроэлементах и других веществах одноглазковые черенки с листом от образцов V. solonis Planch., Кобер 5ББ, Феркаль, Филлоксероустойчивый Джемете, Антей магарачский, Юбилейный Магарача, Подарок Магарача и Интервитис Магарача высаживали на жидкие среды с разными комбинациями концентраций KNO3 (728, 903 и 1050 мг/л) и CaCl2 (256, 424, 584 и 912 мг/л) в сочетании с NH4NO3 (212 мг/л), MgSO4Ł7H2O (96 мг/л), KH2PO4 (68 мг/л), Fe-хелатом и микроэлементами по Мурасиге-Скуга (МС) (14), м-инозитом (20 мг/л) и сахарозой (10 г/л); рН среды 5,0-5,2.
На растениях сортов Антей магарачский, Юбилейный магарача и Подарок Магарача определяли эффективные для образования корневых волосков концентрации MgSO4 и KH2PO4 при изменении концентраций KNO3 и CaCl2. Для этого экспланты высаживали на среды, содержащие MgSO4Ł7H2O и KH2PO4 в концентрациях соответственно 96 и 68; 72 и 51; 48 и 34 мг/л (рассчитаны на основании уравнения регрессии) при концентрациях KNO3 и CaCl2 соответственно 728 и 424; 903 и 584; 1050 и 912 мг/л.
Влияние ИУК (0; 0,1 и 0,3 мг/л) и феруловой кислот (0; 1,0 и 5,0 мг/л), а также витаминов никотиновой кислоты (0,5 мг/л) и м-инозита (20; 50 и 80 мг/л) на образование корневых волосков изучали на растениях подвоя Кобер 5ББ и сорта Подарок Магарача. В этом варианте опыта содержание NH4NO3, KNO3, CaCl2, MgSO4Ł7H2O и KH2PO4 составляло соответственно 212, 728, 424, 96 и 68 мг/л.

Исходные концентрации компонентов жидкой среды подбирали на основании ранее опубликованных данных (11, 13, 15, 16).

Развитие каждого растения оценивали в баллах, суммируя показатели для побегов, листьев и корней. Для побегов: не вытянутый, толстый, не короче средней длины по всем вариантам в опыте — соответственно 5, 3 и 1 балл (или хорошее, среднее и плохое развитие); для листьев: с толстой листовой пластинкой и типичной морфологией; водянистые, большие или средние; светло-зеленые, недоразвитые, мелкие, с тонкой листовой пластинкой — соответственно 5, 3 и 1 балл; для корней: белые, не короче средней длины по всем вариантам в опыте, с боковыми ответвлениями (корнями I порядка); тонкие, местами коричневые или черные; тонкие черные или короткие толстые, без корней I порядка — соответственно 5, 3 и 1 балл.

Показателем, характеризующим образование корневых волосков, была доля растений с развившимися волосками (%) от общего числа растений анализируемого генотипа для соответствующего варианта среды.
Число повторностей по каждому варианту среды для каждого генотипа — 15. Достоверность различий между средними величинами развития растений в баллах (x±m) были установлены для уровня значимости р < 0,05; уровень значимости и детерминации уравнений регрессии — р < 0,05.
Результаты. Известно, что К и N неодинаково влияют на рост побегов и развитие корней растений винограда (17), а Ca играет большую роль в минеральном питании как антагонист других катионов, в особенности К (15), оказывает эффект на поступление в растения В, Mg, Mo, использование солей аммония (3, 15). Ионы Са2+ также нейтрализуют реакцию почвенного раствора, а его недостаток в почве приводит к увеличению подвижности NH4+ и Mg2+ до токсичного для растений уровня (3); в то же время стимуляция роста лозы происходит при достаточно высоком содержании Mg и N (18).

Уравнения регрессии в сторону улучшения развития побегов и корней у изученных генотипов в зависимости от концентрации KNO3 (х1) и CaCl2 (х2) (табл. 1) различались членами, содержащими х1 и х2 в линейном и квадратичном виде, а также в виде парных взаимодействий х1 и х2, что указывает на специфичность влияния изменений этих факторов на растения каждого генотипа. Действительно, концентрации указанных соединений, оптимальные для развития растений сорта Кобер 5ББ (KNO3 и CaCl2 — соответственно 1050 и 912 мг/л) (рис. 1), были наихудшими для других (сорт Филлоксероустойчивый Джемете). То же касалось развития корней I порядка и образования корневых волосков. Однако если для некоторых генотипов было по два варианта сред, на которых наблюдалось наилучшее или наихудшее развитие растений, то образование корневых волосков происходило только в одном варианте для каждого генотипа (очевидно, в связи с тем, что они формировались непосредственно в жидкой среде, которая была нетоксичной для их образования только при определенных для растений каждого генотипа концентрациях KNO3 и CaCl2). При этом такие концентрации оказались одинаковыми для вида V. solonis Planch. и подвоя Феркаль (первый — устойчивый, второй — неустойчивый к засолению почв) — соответственно 903 и 912 мг/л, а также подвоев Кобер 5ББ, Филлоксероустойчивый Джемете (первый — устойчивый, второй — неустойчивый к высокому содержанию активной извести в почве) и сорта Интервитис Магарача — соответственно 1050 и 584 мг/л. Следовательно, связь между формированием корневых волосков при  указанных концентрациях минеральных элементов в среде и этими признаками отсутствует.

Для некоторых генотипов на 30-е и 84-е сут культивирования растений среды, на которых образование корневых волосков происходило лучше, различались (возможно, вследствие дефицита какого-либо из ионов, необходимого для развития листьев и побегов хорошего качества при длительном росте in vitro). Кроме того, в среде, состав которой способствует формированию корней I порядка, может подавляться образование корневых волосков. Лучшие для проявления этих трех показателей варианты минерального состава среды не совпадали у подвоя Кобер 5ББ (по-видимому, для растений этого генотипа оптимальное соотношение KNO3 и CaCl2 отличается от использованных в опыте) (см. табл. 1). Наконец, состав среды может быть оптимальным для развития корневых волосков, корней I порядка и растений на 30-е, но не 84-е сут из-за того, что некоторые минеральные элементы расходуются за столь длительный период культивирования.
Таким образом, была установлена генотипическая специфичность развития растений винограда и образования у них корневых волосков в зависимости от концентраций KNO3 и СаCl2 в жидкой среде на фоне низкого содержания других элементов — NH4NO3 (212 мг/л, или 0,13 MС), MgSO4˛7H2O (96 мг/л, или 0,26 MС) и KH2PO4 (68 мг/л, или 0,4 MС) (см. табл. 1).
При оценке влияния разных концентраций MgSO4˛7H2O (х3) и KH2PO4 (х4) на фоне изменения концентраций KNO3 (х1) и СаCl2 (х2) на развитие растений сортов Антей магарачский, Юбилейный магарача и Подарок магарача (табл. 2) по результатам полного двухфакторного анализа было подобрано уравнение регрессии в сторону оптимизации: у9 = 1,81-0,28х3х4. Расчеты на основании этого уравнения, подтвержденные экспериментально, показали (см. табл. 2), что для хорошего развития растений и образования корневых волосков у всех трех сортов оптимальными были более низкие концентрации MgSO4˛7H2O и KH2PO4 (соответственно 72 и 51 мг/л, факторы х3 и х4). Но при этом для сортов Антей магарачский и Юбилейный магарача оптимальными были концентрации KNO3 и СаCl2 соответственно 728 и 424 мг/л, для сорта Подарок магарача — 903 и 584 мг/л. Иными словами, неблагоприятный для образования корневых волосков и роста растений фон KNO3 (х1) и СаCl2 (х2) (см. табл. 1) можно компенсировать подбором концентраций MgSO4˛7H2O (х3) и KH2PO4 (х4) (см. табл. 2).
Такой же эффект на фоне неоптимальных концентраций KNO3 и СаCl2 (соответственно 728 и 424 мг/л) оказывали ИУК и феруловая кислота (табл. 3). Оптимальное содержание в жидкой среде этих регуляторов роста было неодинаковым для растений разных генотипов винограда: межвидового гибрида (подвоя) Кобер 5ББ — 0,1 мг/л ИУК и 1 мг/л  феруловой кислоты, сорта Подарок магарача — 1 мг/л феруловой кислоты. При содержании феруловой кислоты 5 мг/л корни приподнимали растения сорта Подарок магарача над мостиками из фильтровальной бумаги (рис. 2, см. табл. 3).

Добавление в среду витаминов — никотиновой кислоты (0,5 мг/л) и м-инозита (повышение концентрации до 50 мг/л) (см. табл. 3) вызывало интенсивное развитие корневых волосков и растений у сорта Подарок магарача и улучшало эти показатели у подвоя Кобер 5ББ при неоптимальных концентрациях KNO3 и СаCl2 (соответственно 728 и 424 мг/л) в среде (см. табл. 1).
Ранее, применив математическое планирование эксперимента по улучшению развития растений четырех генотипов винограда (в жидкой и на агаризованной среде), мы разработали состав среды (19), который считаем универсальным: MgSO4˛7H2O — 597 мг/л (1,61 MС);  KH2PO4 — 122 мг/л (0,72 MС), NH4NO3  — 308 мг/л (0,19 MС), KNO3 — 922 мг/л (0,49 MС), СаCl2 — 331 мг/л (1 МС); Fe-хелат и микроэлементы по MС; м-инозит, никотиновая кислота, пиридоксин, тиамин, ИУК — соответственно 20; 0,5; 0,2; 0,1; 0,05 мг/л; сахароза 10 г/л, агар 0,7 % (7 г/л). Тем не менее, при использовании универсальной среды эффективное для развития корней, побегов или всего растения соотношение концентраций MgSO4˛7H2O (370, 562, 597, 632 и 674 мг/л) и KH2PO4 (44, 82, 122, 163 и 370 мг/л) различалось в зависимости от консистенции (жидкая или агаризованная) и для разных генотипов (12), но при этом в жидких средах с высоким (370-674 мг/л) содержанием MgSO4˛7H2O никогда не наблюдалось образование корневых волосков.
Итак, известно, что подвои и корнесобственные сорта винограда значительно различаются по способности расти на почвах с неодинаковым содержанием и доступностью минеральных элементов. Поэтому важным для виноградарства (в том числе для снижения затрат) является создание паспорта генотипа с указанием типа почвы, видов минеральных удобрений и их соотношения (для каждого типа почвы в зависимости от количества осадков и рН почвы), оптимальных для роста и плодоношения, а также физиологических потребностей растений разных генотипов в макро- и микроэлементах. Использовав методику культивирования растений винограда in vitro, мы выявили генотипическую специфичность степени развития и образования у них корневых волосков в жидкой среде с низкой концентрацией NH4NO3 (212 мг/л) и определенными соотношениями KNO3, CaCl2, MgSO4 и КН2РO4. Поскольку при добавлении в среду биологически активных веществ (ИУК и/или феруловая либо никотиновая кислота вместе с м-инозитом) увеличивалось число оптимальных для роста растений и образования корневых волосков соотношений минеральных элементов в питательном растворе, оценку потребности генотипов в содержании минеральных элементов в почве необходимо проводить, не внося в жидкую среду регуляторы роста и витамины. Преимуществами предложенного подхода являются: простота оценки и однозначность показателя (присутствие или отсутствие корневых волосков) по сравнению с определением качества развития растений, которое к тому же изменяется в процессе культивировании in vitro; возможность проводить оценку в первые 10-15 сут культивирования при том, что выявленный таким образом вариант среды оптимален также для роста растения (оценка качества развития растений на 30-е и 84-е сут требует существенно больше времени и менее информативна, поскольку, как мы показали, в эти сроки на одной и той же среде развитие растений одного генотипа может быть разным); объективность и однозначность результата, так как корневые волоски образуются у растений каждого генотипа только в одном варианте, а для показателя качества развития растения на 30-е и/или 80-е сут существует несколько локальных оптимумов соотношения концентраций элементов в среде (два варианта среды для генотипов V. solonis Plansh., Филлоксероустойчивый Джемете и Интервитис Магарача). Использование разработанного нами приема продуктивно также при селекции подвоев, адаптированных к определенным почвенно-климатическим условиям (минеральному питанию), что позволит повысить урожайность привойных сортов (6).

Выражаем искреннюю благодарность нашему учителю ― профессору Р.Г.  Бутенко за консультативную помощь, которая была оказана при проведении исследований.

Л И Т Е Р А Т У Р А

1. У н г у р я н  В.Г. Выбор и оценка почв для посортовой закладки виноградников в Молдавии. Кишинев, 1977.
2. R’ H o u m a  A.,  C h е r i f  M.,  B o u b a k e r  A. Effect of  nitrogen  fertilization, green pruning and fungicide treatments on botrytis bunch rot of grapes. J. Plant Pathol., 1998, 80(2): 115-124.
3. С к в о р ц о в  А.Ф., С о л о в ь е в  С.И. Удобрение виноградников. Киев, 1980.
4. R u l  E.H. Effect of K+ supply on ion uptake and concentration in expressed root sap and xylem sap of several grapevine rootstock varieties. Wein-Wissenschaft, 1993, 48: 61-68.
5. F r а g u a s  J.C.  Nutritional diagnosis of grapes through the percentual balances. Ciencia e Agrotecnologia, 2001, 22(1): 42-46.
6. S c i e n z a  A.,  F a i l l a  O.,  R o m a n o  F. Untersuchungen zur sortenspezifischen mineralstoffaufnahme bei reben. Vitis, 1986, 25: 160-168.
7. B a v a r e s c o  L. Portinnesto e nutrizione minerale della vite. Vignevini (Bologna), 2001, 28: 53-54.
8. K e l l e r  M., K u m m e r  M., C a r m o  V a s c o n c e l o s  M.  Soil nitrogen utilisation for growth and gas exchange by grapevine in response to nitrogen supply and rotstock. Austral. J. of Grape and Wine Res., 2001, 7(1): 2-11.
9. K e l l e r  M., K u m m e r  M., C a r m o  V a s c o n c e l o s  M. Reproductive growth of grapevines in response to nitrogen supply and rootstock. Australian J. of Grape and Wine Research, 2001, 7(1): 12-18.
10. M u r t h y  S.V.K.,  I y e n g a r  B.R.V. Kinetic parameters of nitrogen absorption in varieties and rootstocks of grape (Vitis vinifera). Indian J. Plant Physiol., 1997, 2(3): 232-233.
11. N o v a k  F.J., J u v o v a  Z. Clonal propagation of grapevine through in vitro axillary bud culture. Scientia Horticulturae, 1983, 18: 231-240.
12. S l e n k o  W.A., T r o s c h i n  L.P., K o t i k o w  I.V.  Der Einfluss der Nahrmedienzusammensetzung bei der in vitro — Vermehrung verschiedener Rebgenotypen. Mitteilungen Klosterneuburg, 2001, 51(1): 15-26.
13. Г о л о д р и г а  П.Я.,  З л е н к о  В.А.,  Р ы ф ф  И.И. и др. Технология ускоренного размножения сортов винограда с применением культуры изолированной ткани. С.-х. биол., 1985, 3: 62-66.
14. M u r a s h i g e  T.,  S k o o g  F.A. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture. Phys. Plant, 1962, 15: 473-497.
15. G a r c i a  M.,  D a v e r e d e  C.,  G a l l e g o  P. e.a. Effect of various potassium—calcium ratios on cation nutrition of grape grown hydroponically. J. Plant Nutrit., 1999, 22 (3): 417-425.
16. G a l z y  R. Remarques sur la nutrition minerale des apex de Vitis rupestris. CR. Hebd. Sean. Acad. Sci., 1972, 275: 566-564.
17. G a l z y  R. Remarques sur la croissance de Vitis rupestris cultivee in vitro sur differents milieux nutritifs. Vitis, 1969, 8(3): 191-205.
18. S p i e r s  J.M.,  B r a s w e l l  J.H. Response of sterling muscadine grape to calcium, magnesium and nitrogen fertilization. J. Plant Nutrit., 1994, 17: 1739-1750.
19. Z l e n k o  V.A.,  T r o s h i n  L.P.,  K o t i k o v  I.V. An optimized medium for clonal micropropagation of grapevine. Vitis, 1995, 34(2): 125-126.

Diagnostics of grape genotype requirements of different concentrations of soil mineral substances on the basis of in vitro root hair development in plants

V.A. ZIenko, I.V. Kotikov, L.P. Troshin

S u m m a r y

The root hair development in Vitis solonis, rootstocks and own-rooted grape cultivars was observed using liquid media containing different KNO3 and CaCl2 concentrations and low concentrations of other macroelements, furthermore, in connection with various concentration of MgSO4 and KH2PO4 and also the addition of growth stimulants and vitamins (IUK, ferulic and nicotinic acids, myoinositol). The advantages of the above mentioned diagnostics of grape genotype in mineral substances on the basis of root hair development in vitro was shown in comparison with the estimation of other traits of plant development.