СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ, 2008, № 3, с. 58-61

Генетика и физиология низкотемпературного стресса

УДК 633.11:577.1:577.125.33

ВЛИЯНИЕ ЭКЗОГЕННЫХ ФЕНОЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ НА ПЕРЕКИСНОЕ ОКИСЛЕНИЕ ЛИПИДОВ У РАСТЕНИЙ ПШЕНИЦЫ

Н.А. ОЛЕНИЧЕНКО, Е.С. ГОРОДКОВА, Н.В. ЗАГОСКИНА

Изучали влияние трех экзогенных фенольных соединений на интенсивность перекисного окисления липидов (ПОЛ) в листьях проростков мягкой пшеницы (Triticumaestivum L.) озимого сорта Московская 39 и ярового сорта Амир. Показано, что феруловая кислота, кверцетин и рутин во всех использованных концентрациях (10-4, 10-5 и 10-6 М) способствовали активизации ПОЛ в тканях (особенно кверцетин и рутин). Промораживание проростков (-10 °С, 2 ч), вызывающее окислительный стресс, приводило к усилению ПОЛ в листьях контрольных растений. В этом случае воздействие экзогенных фенольных соединений во всех концентрациях снижало ПОЛ. При этом наибольшим антиоксидантным эффектом обладал кверцетин.

Ключевые слова: фенольные соединения, антиоксиданты, ПОЛ, пшеница.

Key words: phenolic compounds, antioxidants, POL, wheat.

На сельскохозяйственные растения в период вегетации действуют различные неблагоприятные факторы внешней среды, в том числе низкотемпературный стресс. Последний наиболее часто испытывают культуры, возделываемые в странах с холодным и умеренным климатом. При глобальном потеплении, которое сопровождается нестабильностью климатических условий, проблема лишь усугубляется вследствие резких колебаний температуры в относительно короткие промежутки времени. Как правило, в ответ на неблагоприятное воздействие в растительных клетках происходит окислительный взрыв, что связано с накоплением активных форм кислорода (АФК) (1-3). Это приводит к различным структурно-функциональным нарушениям (окислительные повреждения липидов мембран, а также белков и нуклеиновых кислот) вплоть до гибели растения (3).
Важным фактором устойчивости растений к окислительному стрессу является функционирование эффективной многоуровневой антиоксидантной системы, включающей как высокомолекулярные, так и низкомолекулярные соединения (1, 3). К последним относятся фенольные соединения, или полифенолы, являющиеся одними из наиболее распространенных в растительных клетках веществ вторичной природы (3-5). Известно, что многие из них обладают высокой антиоксидантной активностью, не уступающей таковой у аскорбата или a-токоферола (6, 7). Однако вклад фенольных соединений в общую активность антиоксидантной системы изучен еще крайне мало. Предполагают, что они способны инактивировать свободные радикалы, а также могут выступать в качестве субстратов для пероксидаз, таким образом защищая растения от АФК (8, 9).
В связи с этим нашей целью было изучение влияния фенольных соединений на процесс перекисного окисления липидов (ПОЛ) в растительных тканях как одного из первых показателей наличия повреждений, связанных с окислительным стрессом.
Методика. Изучали действие феруловой кислоты, относящейся к группе фенилпропаноидов, а также кверцетина и рутина (3-гликозид кверцетина) из класса флавонолов. Их выбор обусловлен тем, что феруловая кислота — один из основных биогенетических предшественников многих фенольных соединений, синтезируется практически в каждом высшем растении, а упомянутые флавонолы в той или иной форме обычно присутствуют в зеленых тканях растений (4, 5).
Объектом исследования служили 10-суточные проростки мягкой пшеницы (TriticumaestivumL.)озимого (Московская 39) и ярового (Амир) сортов, которые выращивали при температуре 20-22 °С и 16-часовом фотопериоде в рулонах из фильтровальной бумаги на дистиллированной воде (контроль) либо растворах кверцетина, рутина или феруловой кислоты (концентрации 10-4, 10-5, 10-6 М). Для активации процессов ПОЛ проростки промораживали при -10 °С в течение 2 ч. Температура и время воздействия подбирались предварительно с тем условием, чтобы они не оказались летальными для растений, но вызывали окислительный стресс в тканях.
Интенсивность ПОЛ определяли в первых листьях проростков пшеницы (до и после промораживания) по накоплению продукта окисления — малонового диальдегида (МДА), определяемого по цветной реакции с тиобарбитуровой кислотой (ТБК) (10). Для этого навеску свежего материала (100 мг) гомогенизировали в среде выделения, содержащей 0,1 М Трис-HCl буфер (рН 7,5) и 0,35 М NaCl. К 1,5 мл гомогената добавляли 1 мл 0,5 % ТБК в 20 % водном растворе трихлоруксусной кислоты (ТХУ). Реакционную смесь инкубировали на кипящей водяной бане в течение 30 мин, фильтровали и измеряли оптическую плотность фильтрата при длине волны 532 нм. Контролем служила среда выделения с реагентом. Концентрацию МДА рассчитывали в микромолях на 1 г сырой массы по молярной экстинкции (11):
С = D/el,
где C — концентрация МДА, мкмоль; D — оптическая плотность; e — коэффициент молярной экстинкции (1,56Ł105 см-1ŁМ-1); l — длина оптического пути во внутреннем объеме кюветы (1 см). Анализы проводили в двух биологических и двух аналитических повторностях. Результаты обрабатывали статистически (на графиках представлены средние арифметические значения и их стандартные отклонения).
Результаты. Определение ПОЛ показало, что в норме (до промораживания) содержание МДА в листьях проростков было на 35 % выше у озимого сорта Московская 39 по сравнению с яровым Амир (рис., А). О некоторых сортовых различиях в интенсивности образования продуктов ПОЛ в тканях сообщалось в литературе (10).
При выращивании проростков пшеницы на растворах, содержащих различные фенольные соединения, интенсивность ПОЛ в листьях была выше, чем в контроле, при всех использованных концентрациях (10-4, 10-5 и 10-6 М) (см. рис.). В большей степени эти различия проявлялись при действии флавонолов. Кверцетин и рутин повышали содержание МДА в листьях обоих сортов в 1,8-2,2 раза по сравнению с контролем. Феруловая кислота увеличивала его количество всего на 8-40 % относительно контрольного варианта, причем при более низких ее концентрациях (10-5 и 10-6 М) содержание МДА в листьях было выше, особенно у сорта Московская 39. Иными словами, при экзогенном действии фенольных соединений (независимо от их концентрации) отмечалась активация ПОЛ в листьях проростков обоих сортов пшеницы. Возможно, это связано с тем, что в оптимальных условиях роста растений эти вещества проявляют скорее прооксидантное действие, стимулируя тем самым ПОЛ. О том, что фенольные соединения могут выступать в качестве прооксидантов, способствуя выработке перекисей и АФК, также сообщалось в литературе (3).
При определении интенсивности ПОЛ в листьях проростков пшеницы, подвергнутых 2-часовому действию отрицательной температуры (-10 °С) (см. рис., Б), оказалось, что в листьях контрольных растений после такого промораживания происходило увеличение содержания МДА, причем в большей степени — у озимого сорта Московская 39, чем у ярового Амир (соответственно в 1,9 и 1,6 раза по сравнению с контролем до промораживания).

 Работа выполнена при частичной поддержке гранта РФФИ ¹ 07-04-0099.

А

Б

Содержание малонового диальдегида (МДА) в листьях растений при действии экзогенных фенольных соединений в норме (А) и при промораживании проростков (Б) у мягкой пшеницы озимого сорта Московская 39 (а) и ярового сорта Амир (б): 1 — контроль (дистиллированная вода); 2, 3 и 4 — феруловая кислота (соответственно 10-4, 10-5 и 10-6 М); 5 и 6 — кверцетин (соответственно 10-5 и 10-6 М,); 7, 8 и 9 — рутин (соответственно 10-4, 10-5 и 10-6 М).

При действии экзогенных фенольных соединений концентрация МДА в листьях после про-мораживания во всех случаях уменьшалась (см. рис., Б). Наибольшее антиоксидантное действие проявлял кверцетин: в концентрации 10-5 М он в 1,5 раза снижал содержание МДА у растений сорта Амир и почти в 2,0 раза — у растений сорта Московская 39, что соответствовало интенсивности ПОЛ контрольных вариантов (до промораживания проростков). При концентрации кверцетина 10-6 М антиоксидантный эффект был выражен слабее, особенно у сорта Московская 39.
Рутин, являющийся гликозидом кверцетина, в меньшей степени подавлял окислительные процессы, инициированные низкими температурами. При его воздействии у обоих сортов количество МДА в листьях проростков после промораживания снижалось всего на 6-18 % по сравнению с контролем (см. рис., Б).
Что же касается широко распространенного в растениях фенилпропаноида — феруловой кислоты, то она, в целом, проявляла больший антиоксидантный эффект, чем рутин. Причем у сорта Амир при воздействии феруловой кислоты в наименьшей концентрации (10-6 М) содержание МДА в листьях после промораживания уменьшалось на 44 % по сравнению с контролем, что было сопоставимо с эффектом 10-5 М кверцетина, тогда как у сорта Московская 39 количество МДА снижалось максимально (на 27 %) при наибольшей концентрации феруловой кислоты (10-4 М).
Исходя из вышеизложенного, можно заключить, что фенольные соединения выполняют функции как анти-, так и прооксидантов. В оптимальных условиях выращивания, когда процессы образования и инактивации АФК в растительных тканях сбалансированы, интенсивность ПОЛ в контроле была значительно ниже, чем в варианте с воздействием на проростки полифенолов. При этом наибольший эффект в качестве прооксидантов оказывали флавонолы (особенно их свободные формы — агликоны). Подобное действие, вероятно, объясняется легкой окисляемостью этих веществ, что позволяет рассматривать их как источники АФК в клетках растений. Так, при автоокислении многих фенольных соединений растительного происхождения наблюдается образование супероксидных радикалов — одних из наиболее опасных продуктов неполного восстановления кислорода, которые, в свою очередь, являются причиной возникновения других АФК (3). Кроме того, полифенолы в высоких концентрациях могут подавлять пероксидазу, которая использует их в качестве субстрата, способствуя тем самым развитию окислительных процессов (8).
Таким образом, при промораживании проростков пшеницы, приводящем к окислительному взрыву в клетках, изученные фенольные соединения проявляли четко выраженный антиоксидантный эффект, подавляя образование продуктов перекисного окисления липидов. При этом максимальным действием обладал кверцетин в концентрации 10-5 М. Следует отметить, что полученные нами данные еще раз подчеркивают важную роль фенольных соединений в жизнедеятельности растений, в том числе их значительный вклад в функционирование антиоксидантной системы растительных клеток, механизм действия которой зависит от условий окружающей среды и влияния различных стрессовых факторов.  

Выражаем искреннюю признательность академику РАСХН д.б.н. Б.И. Сандухадзе за консультации и помощь в предоставлении сортов пшеницы, использованных в настоящем исследовании.

Л И Т Е Р А Т У Р А

  1. М е р з л я к  М.Н. Активированный кислород и окислительные процессы в мембранах растительной клетки. В сб.: Итоги науки и техники. Сер. Физиол. раст. М., 1989, 6: 5-165.
  2. D r Ö g e  W. Free radicals in the physiological control of cell function. Physiol. Rev., 2002, 82: 47-95.
  3. М е н ь щ и к о в а  Е.Б.,  Л а н к и н  В.З.,  З е н к о в  Н.К. и др. Окислительный стресс. Прооксиданты и антиоксиданты. М., 2006.
  4. H a r b o r n e  J.B. Plant phenolics. In: Secondary plant products /Eds. E.A. Bell, B.V. Charlwood. Berlin, N.-Y., 1980: 329-402.
  5. З а п р о м е т о в  М.Н. Фенольные соединения: распространение, метаболизм и функции в растениях. М., 1993.
  6. Z h a o  H.J.,  Z o u  Q. Protective effects of exogenous antioxidants and phenolic compounds on photosynthesis of wheat leaves under high irradiance and oxidative stress. Photosynthetica, 2002, 40: 523-527.
  7. L i n  C.M.,  C h e n  C.T.,  L e e  H.H. e.a. Prevention of cellular ROS damage by isovitexin and related flavonoids. Planta Med., 2002, 68: 365-367.
  8. Р о г о ж и н  В.В.,  В е р х о т у р о в  В.В.,  К у р и л ю к  Т.Т. Антиоксидантная система в прорастании семян пшеницы. Изв. АН, серия биологическая, 2001, 2: 165-173.
  9. J a n a s  K.M.,  C v i k r o v á  M.,  P a l a g i e w i c z  A. e.a. Constitutive elevated accumulation of phenylpropanoids in soybean roots at low temperature. Plant Sci., 2002, 163: 369-373.
  10. Л у к а т к и н  А.С.,  Г о л о в а н о в а  В.С. Интенсивность перекисного окисления липидов в охлажденных листьях теплолюбивых растений. Физиол. раст., 1988, 35: 773-780.
  11. С т а л ь н а я  И.Д.,  Г а р и ш в и л и  Т.Г. Метод определения малонового диальдегида с помощью тиобарбитуровой кислоты. В сб.: Современные методы в биохимии. М., 1977: 66-68.

Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН,
127276 г. Москва, ул. Ботаническая, 35,
e-mail: phenolic@ippras.ru

Поступила в редакцию
5 июля 2007 года

INFLUENCE OF EXOGENOUS PHENOL COMPOUNDS
ON LIPID PEROXIDATION IN WHEAT

N.A. Olenichenko, E.S. Gorodkova, N.V. Zagoskina

S u m m a r y

The authors investigated the effect of three phenol compounds on lipid peroxidation (LP) intension in seedlings leaves of soft wheat (Triticum aestivum L.) of the Moskovskaya 39 winter variety and the Amir summer variety. It was shown that ferulic acid, quercetin and rutin at the all used concentrations (10-4, 10-5 and 10-6 M) promoted to LP energization in tissues (quercetin and rutin, especially). The freezing of the seedlings (-10 °C, 2 hours), resulting in oxidative stress, intensified LP in leaves of control plants. In that case the exogenous phenol compounds at the all concentrations inhibited LP. At that quercetin has the most antioxidant effect.