СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ, 2008, № 2, с. 40-46

Цитогенетика сельскохозяйственных видов животных

УДК 636.4:577.21

ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА СВИНЕЙ, ТРАНСГЕННЫХ ПОГЕНУ РЕЛИЗИНГ-ФАКТОРА ГОРМОНА РОСТА ЧЕЛОВЕКАmMT1/RhGH

Л.К. ЭРНСТ, Н.А. ВОЛКОВА, П.М. КЛЕНОВИЦКИЙ, Н.А. ЗИНОВЬЕВА, В.А. БАГИРОВ, С.С. ДАНЧ, Г. БРЕМ

У свиней, трансгенных по гену mMT1/RhGH, определяли число ядрышковых организаторов (ЯО) и степень хромосомных аберраций. Показано, что во всех обследованных поколениях число активных ЯО у трансгенных особей было достоверно выше. Хромосомная изменчивость также достоверно превышала таковую у интактных сибсов. Обнаружено, что в ряде поколений, начиная с первичной трансгенной особи, у животных наблюдается стабильное уменьшение доли аберрантных клеток.

Ключевые слова: аберрации, трансгенные свиньи, хромосомы, ядрышковый организатор.
Key words: aberrations, trangenic pigs, chromosomes, nucleolus organizer.

С начала 90-х годов ХХ столетия в лабораториях многих стран ведутся интенсивные работы по генетической трансформации, позволяющие получать животных с запрограммированными свойствами (1-3).
У свиней, трансгенных по гену соматолиберина человека, в ряде поколений отмечено увеличение титра антител при иммунизации тетравалентной вакциной (4), в связи с чем возникла необходимость оценить интенсивность биосинтеза белка на основе использования природных репортерных систем, к которым относятся гены рибосомной РНК (рРНК). Эти специализированные генетические структуры локализованы в ядрышкообразующих районах хромосом (ЯОР).
Уже в ранних цитогенетических работах было показано, что в норме в клетках каждого вида на каждой стадии развития организма функционирует определенное число ядрышковых организаторов (ЯО). Как отмечала еще А.А. Прокофьева-Бельговская (5), повышение функциональной активности клеток сопровождается усилением активности действующих ЯО или активацией дополнительных.
Известно, что скорость биосинтеза белка зависит от количества рибосом в клетке, которое определяется содержанием в цитоплазме компонентов, необходимых для сборки этих органелл, в том числе рРНК (6). Используя в качестве сигнала меченный тритием (H3) уридин, C.C. Morton с соавт. (7) обнаружили, что в фибробластах человека активность ЯО достоверно коррелирует с количеством зрелой рРНК.
Одновременно встает вопрос о стабильности генома трансгенных животных, поскольку показано, что микроинъекции чужеродной ДНК  дестабилизируют геном потомства (1, 8). Установлено, что в ряде случаев трансгенез сопровождается хромосомными перестройками (9). В частности, повышение степени хромосомной изменчивости отмечено у свиней первого поколения, трансгенных по mMT1/hGRF, и кроликов, трансгенных по МСР (10, 11).
Целью настоящей работы было изучение особенностей функционирования ЯО, а также оценка экспрессии генов рРНК и спонтанной цитогенетической изменчивости в ряде поколений свиней, трансгенных по гену соматолиберина человека.

Методика. Исследования выполняли в 1995-2007 годах на помесных свиньях крупная белая ½ ландрас из экспериментального хозяйства Всероссийского НИИ животноводства (ВИЖ) «Кленово-Чегодаево». Анализ ЯО проводили на метафазных хромосомах, полученных из лимфоцитов периферической крови по общепринятой методике (12) с внесенными модификациями (13). В пяти поколениях (2-, 3-, 4-, 6- и 10-е) изучали активность ЯО у 50 потомков от хряка 6331, трансгенного по гену соматолиберина человека (mMT1/RhGH): 29 (трансгенные) — опыт, 21 (не унаследовали экзогенную конструкцию) — контроль. У 23 из 50 животных определяли степень спонтанной изменчивости хромосом.
Для выявления ЯО применяли метод избирательной окраски азотнокислым серебром (Ag+-метод) по W. Howell и D. Black (14), для изучения нарушений хромосомного аппарата — окраску по Романовскому-Гимза. В исследованиях использовали микроскоп Nikon microphot-FX (Япония), цифровую видеокамеру KC-583C (Тайвань), а также систему регистрации и обработки видеоизображений Image Scope 1 («СМА», Россия).
Статистическую обработку результатов проводили методом Стьюдента.
Результаты. Поскольку в работе D.A. Miller с соавт. (15) было показано, что Ag+-метод выявляет только транскрипционно активные кластеры генов рРНК, серебрение ЯО может использоваться в качестве теста, характеризующего интенсивность обменных процессов у животных, трансгенных по генам соматотропного каскада. У свиней ЯОР соответствуют районам вторичных перетяжек 8-й и 10-й пар хромосом, причем для европейских пород характерно преобладание Ag+-окрашенных ЯОР на 10-й паре хромосом (16, 17).

А

Б

 

 

Рис. 1. Метафазы трансгенного по гену соматолиберина человека (А, а-г) и контрольного (Б) подсвинков (10-е поколение). Стрелками показаны ядрышковые организаторы (ЯО): а — два активных на хромосомах 10-й пары; б — два активных на хромосомах 10-й и один — 8-й пары (вверху);  в, г — по че- тыре активных на хромосомах соответственно 8-й и 10-йпар; Б — локализованные на 10-й паре хромосом. Окраска азотнокислым серебром по W. Howell и D. Black (1980). Увеличение ½100. Микроскоп Nikon microphot-FX (Япония), цифровая видеокамера KC-583C (Тайвань), система регистрации Image Scope 1 («СМА», Россия).

В клетках обследованных нами свиней число активных ЯО, окрашенных Ag+-методом, варьировало от 1 до 4. При этом у контрольных животных преобладали метафазы с двумя активными ЯО, локализованными на 10-й паре хромосом в районе вторичной перетяжки (рис. 1, Б), у трансгенных подсвинков отмечали неодинаковое число активных ЯО с разной локализацией (см. рис. 1, А).
В нашем эксперименте в подавляющем большинстве метафаз ЯО четко выявлялись на гомологах 10-й пары. Лишь в единичных случаях метка на одной хромосоме из 10-й пары отсутствовала. Изменения в числе ЯО преимущественно были связаны с наличием дополнительных меток на 8-й паре хромосоме.
Высказывалось мнение (16, 17), что для домашних свиней европейского и азиатского корня характерно четкое различие по числу активных ЯО, а наличие у свиней европейских пород клеток, несущих дополнительные активные кластеры генов рРНК, рассматривалось как погрешность исследования. Однако уже B. Mayr с соавт. (18) показали, что число ЯО, выявляемых в лимфоцитах свиней, для большинства пород является вариабельным признаком. C. Mellink с соавт. (19) и W.S. Liu с соавт. (20), обследовавшие ряд европейских и азиатских домашних и диких свиней, четко продемонстрировали породные различия по числу активных ЯО. Наименьшее отмечали у европейских домашних свиней, причем в среднем оно превышало 2.
В наших исследованиях число активных ЯО в среднем составило 2,36±0,06 (p < 0,001) при значительных индивидуальных различиях (достоверных различий между самцами и самками не обнаружено). У свиней межклеточный и межиндивидуальный полиморфизм по среднему числу ЯО в метафазах отмечен также В.Н. Стефановой (21).
Показано, что уровень экспрессии рибосомных генов, локализованных в отдельных ЯОР, в клетках может варьировать (22, 23). Для оценки активности рибосомных генов принята полуколичественная система по сумме баллов (24). Однако число активных центров синтеза рРНК у свиней в несколько раз ниже, чем у человека, в связи с чем на балльную оценку в большей степени влияет субъективный фактор. Поэтому при анализе экспрессии рибосомных генов мы основывались на подсчете числа активных ЯО (табл.).

 Среднее число активных ядрышковых организаторов (ЯО) в ряде поколений у свиней, трансгенных по mMT1/RhGH, и контрольных животных

Поколение

Среднее число ЯО, число обследованных животных

трансгенные
животные

контроль

разность

2-е

2,35±0,11, n = 7

1,94±0,05, n = 3

0,41±0,12**

3-е

2,31±0,05, n = 4

1,97±0,02, n = 4

0,34±0,06**

4-е

2,80±0,20, n = 4

2,36±0,12, n = 6

0,44±0,23*

6-е

2,52±0,08, n = 10

2,05±0,09, n = 5

0,47±0,12**

10-е

2,88±0,12, n = 4

2,00±0,07, n = 3

0,88±0,14***

В среднем

2,54±0,11, n = 29

2,10±0,04, n = 21

0,44±0,12***

 * p < 0,1; **  p < 0,01; *** p < 0,001 (по критерию Стьюдента).

Результаты ста-тистического анализа свидетельствуют, что во всех обследованных поколениях число активных ЯО у трансгенных свиней было достоверно вы-ше. Разность между показателями у трансгенных и контрольных животных колебалась от 0,34 в 3-м до 0,88 в 10-м поколениях и в среднем составляла 0,36 (p < 0,001 при оценке по критерию Стьюдента).
Механизм активации дополнительных кластеров генов рРНК в лимфоцитах у трансгенных по гену соматолиберина человека свиней, вероятно, связан с повышенной секрецией соматотропина, которую стимулирует экзогенный соматолиберин, и воздействием этого гормона на регуляторные механизмы клеток.

Известно, что основным свойством гормона роста является способность усиливать белковый обмен. Гормон роста активирует синтез нуклеиновых кислот, в том числе иРНК и тРНК (25, 26), что со-провождается ростом числа рибосом и полисом и, следовательно, неизбежным усилением синтеза рРНК. Однако конкретизировать этот механизм достаточно сложно, поскольку гормон роста не имеет определенной периферической мишени. Активирующий эффект сомато-тропина, очевидно, возникает в результате его связывания со спе-цифическими рецепторами клеток. Для ряда гормонов показано, что их функциональная активность зависит от способности «сшивать» на поверхности клетки специфические рецепторы (27). Не исключено, что ЯО-стимулирующее действие соматолиберина появляется при связывании соматотропина или инсулиноподобного фактора роста со специфическими рецепторами инсулина. Возможно и то, что в процессе активации ЯО принимают участие механизмы иммунного ответа. Однако в этом случае трудно объяснить причины возникновения числовых вариаций активных ЯОР в лимфоцитах у нетрансгенных животных, отмеченных нами, а также другими авторами у большинства обследованных пород свиней и жи-вотных других видов.

 Рис. 2. Нормальный кариотип хряка 0438, транс-генного по гену соматолиберина человека.

Кариотип у всех обследованных трансгенных свиней в большинстве клеток содержал 38 хромосом, соответствующих  видовой норме (рис. 2). Однако в некоторых клетках встречались различные хромосомные аберрации. Подавляющее число нарушений, обнаруженных у контрольных животных, составляли одиночные хроматидные пробелы и разрывы; только единичные клетки несли изохроматидные разрывы. В то же время в некоторых клетках встречались различные хромосомные аберрации.
У трансгенных по гену соматолиберина человека животных  были обнаружены как разрывы, так и более сложные перестройки хромосом, представленные дицентриками (рис. 3).
Необходимо отметить, что дицентрические хромосомы выявили только у трансгенных свиней 2-го и 3-го поколений (доля клеток с дицентриками составляла соответственно 2,4 и 2,6 %). У животных 2-го поколения в 3,6 % исследованных клеток наблюдали пульверизацию хромосом, в остальных поколениях пульверизацию хромосом не обнаружили. Начиная с 4-го поколения, аберрации хромосом были представлены только пробелами и разрывами.
При оценке динамики изменения частоты аберрантных клеток по поколениям (рис. 4) выяснилось, что у трансгенных особей 2-го поколения этот показатель в среднем был равен 38,8 %, в 3-м — достоверно снижался до 24 % (p < 0,001), в 4-м, 6-м и 10-м — становился достоверно меньше, чем во 2-м и 3-м (p < 0,001). Минимальное число хромосомных аберраций отмечали в контроле. 

 

Эрнст(3).jpg  

Эрнст(3).jpg  

 Рис. 3. Хромосомные аберрации, выявленные в метафазах у свиней, трансгенных по гену соматолиберина человека: а — хроматидные разрывы в коротком и длинном плечах хромосом 1-й пары (показаны стрелками), б — дицентрические хромосомы (показаны стрелками), в — пульверизация хромосом.

Таким образом, анализ данных литературы и результаты проведенного исследования свидетельствуют, что активность рибосомных генов отражает изменение интенсивности метаболитических процессов у свиней в норме и при различных нагрузках. Изучение этого показателя представляет интерес при оценке физиологических особенностей животных, в том числе генетически трансформированных.

 

Рис. 4. Степень хромосомной изменчивости в поколениях свиней, трансгенных по гену соматолиберина человека. Ромбами и квадратами отмечены показатели со-ответственно для трансгенных и контрольных животных.

Активность ядрыш-кообразующих районов у свиней, трансгенных по гену соматолиберина человека, характеризуется устойчивым повышением на протяжении длительного времени. Очевидно, в значительной мере этот признак генетически детерминирован, что позволяет использовать его в качестве теста при оценке состояния клеточных систем белкового синтеза у животных. С увеличением числа поколений от получения первичной трансгенной особи у трансгенных животных наблюдается стабильное уменьшение доли аберрантных клеток. Аналогичные данные получены нами ранее на кроликах. Все это указывает на то, что уровень хромосомной изменчивости связан, скорее всего, не с интеграцией и экспрессией экзогена, а с эффектом сопутствующей мутации, подобной той, которая вызывает повышенную ломкость хромосом у человека при пигментной ксеродерме. Возможно, такая мутация возникла как результат генно-иженерных манипуляций с эмбрионом, давшим начало последующим поколениям трансгенных свиней, однако она, скорее всего, не сцеплена с самим экзогеном.
Итак, наши данные позволяют предположить, что нестабильность хромосом у обследованных животных зависит от взаимодействия их генотипа и внешних факторов, характер которого изменяется в присутствии экзогена. Независимо от функции последнего его интеграция в геном организма-хозяина оказывает дестабилизирующее влияние на хромосомный набор, что необходимо учитывать при сохранении и размножении трансгенных животных.

Л И Т Е Р А Т У Р А

  1. B r e m  G. Trangenic animals. Byotechnology, 1993, 2: 745-832.
  2. Э р н с т  Л.К. Проблемы селекции и биотехнологии сельскохозяйственных животных. М., 1995.
  3. З и н о в ь е в а  Н.А.,  Э р н с т  Л.К.,  Б р е м  Г. Трансгенные животные и возможности их использования. М., 2001.
  4. Э р н с т  Л.К.  Генетические основы селекции сельскохозяйственных животных. М., 2004.
  5. П р о к о ф ь е в а - Б е л ь г о в с к а я  А.А. Материальные основы наследственности. В кн.: Основы цитогенетики человека /Под ред. А.А. Прокофьевой-Бельговской. М., 1969: 9-63.
  6. С т е н т  Г.,  К э л и д е р  Р. Молекулярная генетика. М., 1986.
  7.  M o r t o n  C.,  B r o w n   J.A.,  H o l m e s   W.A. e.a. Stain intensity of human nucleolus organizer region reflects incorporation of uridine in to mature ribosomal RNA. Expl. Cell Res., 1983, 145(2): 405-413.
  8. К л е н о в и ц к и й  П.М.,  Н е к р а с о в  А. А. Мутационные изменения у трансгенных животных. В сб. научн. тр. ВИЖ: Актуальные проблемы развития животноводства. Дубровицы, 1998, вып. 57, ч. 4: 184-191.
  9. M a r x  J.L. Making mutant mice by gene transfer. Science, 1985, 228: 1516-1517.
  10. B a g i r o v  V.A.,  K l e n o v i t s k y  P.M.,  Z i n o v´ e v a   N.A. Analysis of chromosome aberrations in transgenic pigs and rabbits. In: Book of Abstracts of the 54th Annual Meeting of  the European  Association  for Animal Production. Animal Genetics. Rome, Italy, 2003: 14.
  11. Z i n o v´ e v a  N.,  K l e n o v i t s k y  P.,  D o z e v  A. e.a. Comparative study of chromosomal status in transgenic and nontrangenic rabbits. In: Proc. Intern. conf. «Actual problems of DNA-technologies and cell engineering of agricultural animals». Dubrovitzy, 2001: 125-126.
  12. Г р а ф о д а т с к и й  А.С.,  Р а д ж а б л и  С.И. Хромосомы сельскохозяйственных и лабораторных млекопитающих. Атлас. Новосибирск, 1988.
  13. К л е н о в и ц к и й  П.М.,  М о и с е й к и н а  Л.Г.,  Ж и в а л е в  И.К. Лабораторный практикум по цитогенетике животных. Элиста, 1997.
  14. H o w e l l  W.,  B l a c k  D. Controlled silver staining of nucleolus organizer regions with a protective colloidal developer: in a one step method. Experientia, 1980, 36: 1014-1015.
  15.  M i l l e r  D. A.,  B r e g  W. R.,  W a r b u r t o n  D. e.a. Regulation of rRNA gene expression in a human familial 14p+ marker chromosome. Hum. Genet., 1978, 43(2): 289-297.
  16. Г р а ф о д а т с к и й  А.С. Ядрышкообразующие районы хромосом домашней свиньи. Цит. и ген., 1981, 15(5): 29-31.
  17. M e l l i n k  C.H.M.,  B o s m a  A.A.,  d e  H a a n  N.A. e.a. Distribution of rRNA genes in breeds of domestic pig studied by non-radioactive in situ hybridization and selective silverstaining. Genet. Select. Evol., 1991, 23(1): 168-172.
  18. M a y r  B.,  S c h w e i z e r  D.,  G e b e r   G. NOR activity, heterochromatin differentiation, and Robertsonian polymorphism in Sus scrofa L. J. Heredity, 1984, 75(1): 79-80.
  19. M e l l i n k  C.H.M.,  B o s m a  A. A.,  d e  H a a n  N.A. e.a. Numerical variation of nucleolar organizer regions after silver staining in domestic and wild Suidae (Mammalia). Anim. Genet., 1992, 23(3): 231-239.
  20. L i u  W.S.,  L u  X.Z.,  Q i u  H. Number and distribution of silverstained nucleolar organizer regions and evolutionary relationships in domestic pig. Anim. Genet., 1995, 26(5): 293-298.
  21. С т е ф а н о в а  В.Н. Количественная характеристика ядрышкообразующих районов хромосом свиней. Бюл. ВНИИРГЖ, Л.-Пушкин, 1983, 67: 6-10.
  22. С о з а н с к и й  О.А.,  К о н о в а л о в а  Т.В.,  Я в о р о в с к а я  О. М. и др. Структурная стабильность ядрышкообразующих районов хромосом человека. В кн.: Хромосомы человека в норме и патологии. М., 1989: 63-73.
  23. D e  C a p o a  A.,  A l e i x a n d r e  C.,  F e l l i  M.P. e.a. Inheritance of ribosomal gene activity and level of DNA methylation individual gene clusters in a three generation family. Hum. Genet., 1991, 88(2): 146-152.
  24. Л я п у н о в а  Н. А.,  Е г о л и н а  Н.А.,  М х и т а р о в а  Е.В. и др. Межиндивидуальные и межклеточные различия суммарной активности рибосомных генов, выявляемых Ag-окраской ядрышкообразующих районов акроцентрических хромосом человека. Генетика, 1988, 26(7): 1282-1288.
  25. K o s t y o  J.L. Rapid effect of growth hormone on amino acid transport and protein synthesis. Ann. N.Y. Acad. Sci., 1980, 148(2): 284-312.
  26. K o s t y o  J.L.,  N u t t i n g  D.K. Growth hormone and protein metabolism. In: Handbook of physiology. Washington DC, 1979, IV (2): 187-210.
  27. К у л ь б е р г  А.Я. Молекулярная иммунология. М., 1985.

 

ГНУ Всероссийский НИИ животноводства
Россельхозакадемии,

142132 Московская обл., Подольский р-н, пос. Дубровицы,
e-mail: klenpm@mail.ru;
Институт животноводства и генетики
ветеринарно-медицинского университета
,
Ф-1210, г. Вена, Австрия.

Поступила в редакцию
15 января 2008 года

CYTOGENETIC CHARACTERISTIC OF PIGS TRANSGENIC ON THE GENE OF RELEASING-FACTOR OF HUMAN GROWTH HORMONE mMT1/RhGH

L.K. Ernst, N.A. Volkova, P.M. Klenovitskii, N.A. Zinov’eva,
V.A. Bagirov, S.S. Danch,
G. Brem

S u m m a r y

In pigs transgenic of the mMT1/RhGH gene the number of nucleolar organizer (NO) and the degree of chromosome aberration were determined. It was shown that among all examined generation the transgenic individuals have higher number of active NO. The chromosome variability was also higher with certainty than such parameter in intact sibs. It was revealed that in series generations, starting from initial transgenic individual, the number of aberrant cells in animals stable decreases.