doi: 10.15389/agrobiology.2025.6.rus
УДК 636.2: 91.39
Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (проект № 24-16-00261).
ОСОБЕННОСТИ ВЛИЯНИЯ ИНСУЛИНОПОДОБНОГО
ФАКТОРА РОСТА 1 И ФАКТОРА РОСТА ФИБРОБЛАСТОВ 2
НА КАЧЕСТВО СОЗРЕВАЮЩИХ ООЦИТОВ И ИХ СПОСОБНОСТЬ
К ЭМБРИОНАЛЬНОМУ РАЗВИТИЮ in vitro У КРУПНОГО РОГАТОГО
СКОТА (Bos taurus taurus)
Г.Н. СИНГИНА✉, Е.Н. ШЕДОВА, А.В. ЛОПУХОВ, А.С. ЖУКОВА
Экстракорпоральное созревание (in vitro maturation, IVM) — неотъемлемый этап получения эмбрионов in vitro (in vitro embryo production, IVP). Условия IVM критически влияют на качество яйцеклеток и развившихся из них IVP эмбрионов, но в настоящее время остаются субоптимальными и требуют усовершенствования. В настоящей работе мы впервые установили, что коровьи ооциты, созревшие in vitro при воздействии IGF1 и FGF2, а затем стареющие при пролонгированном культивировании в их отсутствие, различаются по способности развиваться до стадии бластоцисты после экстракорпорального оплодотворения. Цель работы заключалась в сравнительном изучении влияния двух клеточных цитокинов (инсулиноподобного фактора роста 1 и фактора роста фибробластов 2) в среде in vitro созревания коровьих ооцитов на их качество, способность к эмбриональному развитию, а также устойчивость к возрастным трансформациям. Яичники половозрелых коров (Bos taurus taurus), собранные после убоя животных, были доставлены в лабораторию в физиологическом растворе в течение 4-6 ч при температуре не ниже 28 °С. Ооциты в составе ооцит-кумулюсных комплексов (ОКК) выделяли из фолликулов яичников механическим способом: рассекали стенки видимых фолликулов лезвием, после чего проводили поиск и промыв извлеченных ОКК. Группы из отобранных 20-25 ОКК созревали in vitro в контрольной среде ТС-199С, содержащей HEPES (25 мМ), Na-пируват (0,5 мМ), фолликулостимулирующий и лютеинизирующий гормоны (каждый по 10 мкг/мл), эпидермальный фактор роста (20 нг/мл), а также фетальную бычью сыворотку (ФБС, 10 %) и антибиотик гентамицин (50 мкг/мл) в течение 20 ч. В опытных группах в среде IVM аналогичного состава дополнительно присутствовал IGF1 («Thermo Fisher Scientific, Inc.», США) или FGF2 («Thermo Fisher Scientific, Inc.», США) в концентрации 20 и 40 нг/мл, соответственно. После IVM часть созревших ОКК переносили в среду старения (ТС-199 c 10 % ФБС) и культивировали дополнительно в течение следующих 12 или 24 ч. Непосредственно после IVM и через 24 ч старения в ооцитах оценивали степень апоптоза (метод TUNEL), а в первом случае дополнительно проводили анализ стадий мейоза. Процесс ядерного созревания оценивали по доле ооцитов на различных стадиях мейоза к общему числу культивируемых ооцитов, апоптоз — по доле TUNEL-позитивных ооцитов на стадии метафазы II от общего числа МII-ооцитов. Часть созревших ооцитов, а также ооциты, стареющие в течение 12 ч, подвергали экстракорпоральному оплодотворению (ЭКО) и культивированию для эмбрионального развития. Для оценки качества полученных бластоцист готовили и анализировали их цитологические препараты. Степень созревания ооцитов — достижение стадии метафазы II (MII) мейоза — значимо не различалась между группами и составила 76,5-82,5 %. В то же время воздействие IGF1 и FGF2 на ооциты приводило к снижению частоты апоптотических изменений MII хромосом: через 20 ч IVM — с 22,5±1,4 в контроле до 7,6±1,4 и 12,3±0,2 %; после 24 ч старения — с 40,8±1,8 в контроле до 23,2±1,0 и 19,8±0,78 % (p < 0,001). При этом для 20 ч IVM между опытными вариантами наблюдались различия в пользу IGF1 (р < 0,05). Также было обнаружено положительное влияние IGF1 на эмбриональное развитие ооцитов: выход бластоцист после ЭКО созревших (20 ч IVM) и стареющих (12 ч) ооцитов составил соответственно 37,0±5,50 и 23,3±2,9 и был выше, чем в контрольных группах, соответственно на 16 и 12 % (p < 0,05). При использовании IGF1 также повышалось качество полученных бластоцист (снижение доли ядер с признаками апоптоза) по сравнению с контролем (p < 0,05). Позитивное влияние FGF2 на эмбриональное развитие наблюдалось только в отношении ооцитов, подвергшихся ЭКО непосредственно после IVM, в стареющих ооцитах оно не проявлялось. Следовательно, IGF1 на этапе IVM повышает качество ооцитов, включая их устойчивость к возрастным изменениям, и может быть использован для повышения эффективности получения IVP эмбрионов у крупного рогатого скота.
Ключевые слова: инсулиноподобный фактор роста 1, фактор роста фибробластов 2, in vitro созревание, старение, эмбриональное развитие, апоптоз, крупный рогатый скот.
G.N. Singina✉, E.N. Shedova, A.V. Lopukhov, A.S. Zhukova
In vitro maturation (IVM) is an essential component of in vitro embryo production (IVP). The conditions under which IVM is performed critically determine the quality of oocytes and the resulting IVP embryos; however, current maturation protocols remain suboptimal and require further improvement. In the present study, we demonstrate for the first time that bovine oocytes matured in vitro in the presence of IGF1 or FGF2, and subsequently subjected to prolonged cytokine-free culture, differ in their ability to develop to the blastocyst stage following in vitro fertilization (IVF). The aim of this work was to comparatively assess the effects of two cytokines, the insulin-like growth factor 1 (IGF1) and fibroblast growth factor 2 (FGF2) when added to the oocyte in vitro maturation medium, focusing on oocyte quality, embryonic developmental potential, and resistance to age-related alterations. Ovaries from sexually mature cows (Bos taurus taurus) were collected post-mortem and transported to the laboratory in physiological saline within 4-6 h at a temperature not below 28 °C. Cumulus–oocyte complexes (COCs) were mechanically isolated from visible follicles by dissecting follicular walls with a scalpel blade, followed by retrieval and washing of the collected complexes. Groups of 20-25 selected COCs were matured in vitro for 20 h in control TC-199C medium supplemented with HEPES (25 mM), sodium pyruvate (0.5 mM), follicle-stimulating and luteinizing hormones (10 mg/ml each), epidermal growth factor (20 ng/ml), fetal bovine serum (10 %), and gentamicin (50 mg/ml). Experimental groups received identical medium supplemented with IGF1 (20 ng/ml) or FGF2 (40 ng/ml). After IVM, a subset of matured COCs was transferred into an aging medium (TC-199 with 10 % serum) and cultured for an additional 12 or 24 h. Immediately after IVM and after 24 h of aging, apoptosis was evaluated using the TUNEL assay; in the former case, meiotic staging was additionally performed. Nuclear maturation was quantified as the rate of oocytes at specific meiotic stages, while apoptosis was assessed as the rate of TUNEL-positive metaphase II (MII) oocytes among the total MII population. A portion of matured oocytes and oocytes aged for 12 h underwent IVF and subsequent embryo culture. Blastocyst quality was assessed using cytological preparations. Oocyte maturation rate (progression to meiosis II metaphase, MII) did not differ between groups, ranging from 76.5 % to 85.2 %. However, IGF1 and FGF2 treatments reduced apoptotic degeneration in MII oocytes: from 22.5±1.4 % in control to 7.6±1.4 % and 12.3±0.2 % after 20 h IVM, respectively (p < 0.001), and from 40.8±1.8 % in control to 23.2±1.0 % and 19.8±0.78 % after 24 h aging respectively (p < 0.001). For the 20-h IVM period, IGF1 demonstrated a significantly stronger protective effect than FGF2 (p < 0.05). In addition, IGF1 enhanced in vitro embryonic development: blastocyst rate following in vitro fertilization of matured (20 h IVM) and aged (12 h) oocytes reached 37.0±5.50 % and 23.3±2.9 %, exceeding control values by 16 % and 12 %, respectively (p < 0.05). Furthermore, IGF1 improved blastocyst quality by reducing the apoptosis rate in blastocysts (p < 0.05). FGF2 exerted a positive effect only on oocytes fertilized immediately after IVM, with no benefit observed in aged oocytes. Thus, IGF1 exposure during IVM enhances oocyte quality, including the resistance of bovine oocytes to subsequent age-related, and may serve as an effective means of improving IVP efficiency in cattle.
Keywords: insulin-like growth factor 1, fibroblast growth factor 2, in vitro maturation, aging, embryonic development, apoptosis, cattle.
ФГБНУФедеральный исследовательский центр |
Поступила в редакцию Принята к публикации |
