doi: 10.15389/agrobiology.2024.6.1192rus
УДК 1192-1203
Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда № 24-26-00034, https://rscf.ru/project/24-26-00034/
ИССЛЕДОВАНИЕ АНТИМУТАГЕННОГО ДЕЙСТВИЯ ГИДРОФИЛЬНОЙ КРИОФРАКЦИИ СЕЛЕЗЕНКИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
Г.А. ВОСТРОИЛОВА ✉, С.В. ШАБУНИН, Д.И. ШАБАНОВ,
Н.А. ХОХЛОВА, А.А. КОРЧАГИНА, М.Ю. СЫРОМЯТИКОВ,
А.В. НЕКРАСОВ, М.А. СЕЛЮТИНА, Д.Д. МОРОЗОВА
Высокие производственные нагрузки и ухудшение экологической обстановки приводят к усилению действия различных факторов, которые способны вызывать мутации в клетках сельскохозяйственных животных. Накопление мутаций приводит к возникновению заболеваний, нарушению иммунных функций, снижению набора массы, частичной или полной стерильности, потере ценных признаков породы, вызывает гибель, а также отражается на следующих поколениях. Одним из способов снижения накопления повреждений ДНК в организме считают применение препаратов, обладающих антимутагенным действием. Фармакологические субстанции, полученные из тканей животных, например селезенки крупного рогатого скота (КРС), могут стать перспективной основой для препаратов с такими свойствами. В настоящей работе впервые установлено антимутагенное действие гидрофильной криофракции селезенки КРС на клетки костного мозга мышей, а также ДНК-защитное действие по отношению к митохондриальной ДНК (мтДНК) печени мышей в условиях цитогенетической нестабильности, индуцированной экспериментальным мутагеном митомицином С. Также показано влияние гидрофильной криофракции селезенки КРС на некоторые маркеры окислительного стресса в клетках печени мышей при введении животным митомицина С. Целью работы было определение влияния гидрофильной криофракции селезенки крупного рогатого скота на цитогенетическую стабильность клеток костного мозга и целостность мтДНК печени мышей, а также оценка ее антимутагенного и ДНК-протекторного действия на мышах с индуцированной митомицином С (ММС) цитогенетической нестабильностью. Гидрофильная криофракция селезенки КРС (ГКСК) была получена в ФГБНУ ВНИВИПФиТ. Положительным контролем служил препарат Митомицин С Киова («Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd», Япония), содержащий в качестве действующего вещества митомицин. Опыты проводили в 2024 году. Использовали самцов белых беспородных мышей (Mus albus officinarum) (n = 30) с массой тела 26,0±2,0 г. Были сформированы пять групп животных (n = 6). В I группе (отрицательный контроль) животным однократно внутримышечно вводили стерильный изотонический раствор хлорида натрия в объеме 0,1 мл. Во II группе мыши получали однократно внутримышечную инъекцию ГКСК в дозе 0,5 мл/кг в объеме 0,1 мл. Животным III группы вводили 3-кратно внутримышечно с интервалом в 24 ч ГКСК в дозе 0,5 мл/кг в объеме 0,1 мл и совместно с последней инъекцией ГКСК однократно внутрибрюшинно ММС в дозе 10 мг/кг в объеме 0,5 мл. Животным IV группы вводили внутримышечно однократно ГКСК в дозе 0,5 мл/кг в объеме 0,1 мл и однократно внутрибрюшинно ММС аналогично III группе. Мыши из V группы (положительный контроль) получали однократно интраперитонеально ММС в дозе 10 мг/кг в объеме 0,5 мл. Мышей выводили из эксперимента через 24 ч после последней инъекции посредством передозировки углекислого газа в специальной камере. Для исследования частоты полихроматофильных эритроцитов (ПХЭ) с микроядрами (микроядерного теста) клетки костного мозга из бедренных костей добавляли к инактивированной фетальной телячьей сыворотке («БиолоТ», Россия) и наносили на предметные стекла, далее препараты высушивали и окрашивали по Папенгейму. Исследовали частоту ПХЭ с микроядрами на 1000 ПХЭ, также учитывали отношение ПХЭ к нормохромным эритроцитам (НЭ). Относительное количество повреждений в мтДНК оценивали методом qPCR. Для этого выделяли тотальную ДНК из 25 мг гомогенизированной печени мышей при помощи набора ПРОБА-ГС («ДНК-технология», Россия). Расчет повреждений мтДНК проводили в участках, кодирующих 12S и 16S рРНК (12S-16S) и ген ND5(ND5). Суммарное относительное содержание внутриклеточных активных форм кислорода (АФК) определяли с помощью клеточного зонда — 2´,7´-дихлордигидрофлуоресцеиндиацетата («Sigma-Aldrich», США), который, окисляясь внутри живых клеток, образует флуоресцирующую форму (DCF), детектируемую с помощью спектрофлуориметра RF-5301 («Shimadzu», Япония). Содержание внутриклеточных АФК оценивали в суспензии клеток печени мышей (3×106 кл/мл). Концентрацию малонового диальдегида (МДА) определяли в гомогенате печени мышей с помощью спектрофотометра UV-1700 («Shimadzu», Япония) по окрашиванию раствора при λ = 535 нм триметиновым комплексом. В результате экспериментов мы не обнаружили значимых отличий от негативного контроля всех исследуемых параметров у мышей из II группы. Так во II группе частота ПХЭ с микроядрами составляла 0,41±0,080 %, количество повреждений мтДНК во фрагментах 12S-16S и ND5 — соответственно 0,0±0,92 и 2,2±0,45. Введение ММС в V группе приводило к увеличению частоты ПХЭ с микроядрами в костном мозге мышей до 11,20±1,000 %. Количество повреждений мтДНК печени возрастало до 4,1±0,44 и 4,2±0,30 во фрагментах 12S-16S и ND5, что сопровождалось увеличением содержания внутриклеточных АФК до 314,0±44,20 отн. ед и концентрации МДА до 1,7±0,15 мкмоль/г. При этом курсовое введение ГКСК вместе с ММС (III группа) снижало частоту ПХЭ с микроядрами на 27,4 % (p < 0,05) до 8,20±1,070 %, а также повреждение мтДНК на 89,7 % (p < 0,05) во фрагменте 12S-16S до 0,4±1,27 относительно позитивного контроля. Выявленные изменения в III группе могли быть частично обусловлены обнаруженным нами снижением содержания внутриклеточных АФК на 58,1 % (p < 0,005) до 131,7±9,84 отн. ед. и концентрации МДА на 58,6 % (p < 0 ,005) до 0,7±0,08 мкмоль/г в печени мышей относительно позитивного контроля. Эти данные свидетельствуют о наличии у гидрофильной криофракции селезенки КРС антимутагенных, ДНК-протекторных свойств, которые, вероятно, обусловлены ее антиокислительным действием за счет активации систем антиоксидантной защиты.
Ключевые слова: гидрофильная криофракция селезенки КРС, мутагенность, антимутагенное действие, повреждение ДНК, митохондриальная ДНК, митомицин, микроядерный тест, свободнорадикальное окисление, мыши.
STUDY OF ANTIMUTAGENIC EFFECT OF HYDROPHILIC CRYOFRACTION OF BOVINE SPLEEN
G.A. Vostroilova ✉, S.V. Shabunin, D.I. Shabanov,
N.A. Khokhlova, A.A. Korchagina, M.Yu. Syromyatnikov,
A.V. Nekrasov, M.A. Selyutina, D.D. Morozova
High production loads and deterioration of the environmental situation lead to an increase in the effect of various factors that can cause mutations in the cells of farm animals. The accumulation of mutations leads to the occurrence of diseases, disruption of immune functions, decreased weight gain, partial or complete sterility, loss of valuable breed traits, causes death and also affects the next generations. The use of drugs with an antimutagenic effect is considered to be one of the ways to reduce the accumulation of DNA damage in the body. Pharmacological substances obtained from animal tissues, such as bovine spleen, can become a promising basis for drugs with such properties. In this work, we have established the antimutagenic effect of hydrophilic cryofraction of bovine spleen on bone marrow cells of mice for the first time, as well as the DNA-protective effect on mitochondrial DNA (mtDNA) of mouse liver under conditions of cytogenetic instability induced by the experimental mutagen mitomycin C. We have also shown the effect of hydrophilic cryofraction of bovine spleen on some markers of oxidative stress in mouse liver cells upon administration of mitomycin C to animals. The aim of the work was to determine the effect of hydrophilic cryofraction of bovine spleen on the cytogenetic stability of bone marrow cells and the integrity of mtDNA of mouse liver, as well as to assess its antimutagenic and DNA-protective effects on mice with mitomycin C (MMC)-induced cytogenetic instability. Hydrophilic cryofraction of bovine spleen (HCBS) was obtained at the FSBSI ARVRIPP&T. The positive control was the drug Mitomycin C Kyowa (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd, Japan), containing mitomycin as the active substance. The experiments were conducted in 2024. Male white outbred mice (Mus albus officinarum) (n = 30) weighing 26.0±2.0 g were used. Five groups of animals (n = 6) were formed. In group I (negative control), the animals were given a single intramuscular injection of sterile isotonic sodium chloride solution in a volume of 0.1 ml. In group II, the mice were given a single intramuscular injection of HCBS at a dose of 0.5 ml/kg in a volume of 0.1 ml. The animals of group III were administered HCBS at a dose of 0.5 ml/kg in a volume of 0.1 ml and together with the last injection of HCBS intramuscularly three times with an interval of 24 h, a single intraperitoneal injection of MMC at a dose of 10 mg/kg in a volume of 0.5 ml. The animals of group IV were administered HCBS at a dose of 0.5 ml/kg in a volume of 0.1 ml intramuscularly once and a single intraperitoneal injection of MMC similarly to group III. The mice from group V (positive control) were given a single intraperitoneal injection of MMC at a dose of 10 mg/kg in a volume of 0.5 ml. The mice were eliminated from the experiment 24 hours after the last injection by means of an overdose of carbon dioxide in a special chamber. To study the frequency of polychromatophilic erythrocytes (PCE) with micronuclei (micronucleus test), bone marrow cells from femurs were added to inactivated fetal bovine serum (BioloT, Russia) and applied to glass slides, then the preparations were dried and stained according to Papenheim. The frequency of PCE with micronuclei per 1000 PCE was studied, and the ratio of PCE to normochromic erythrocytes (NE) was also accounted. The relative number of damages in mtDNA was estimated by qPCR. For this purpose, total DNA was isolated from 25 mg of homogenized mouse liver using the PROBA-GS kit (DNA Technology, Russia). Calculation of mtDNA damage was performed in the regions encoding the 12S and 16S rRNA (12S-16S) and the ND5 gene (ND5). The total relative content of intracellular reactive oxygen species (ROS) was determined using a cellular probe, 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (Sigma-Aldrich, USA), which, when oxidized inside living cells, forms a fluorescent form (DCF) detected using a RF-5301 spectrofluorimeter (Shimadzu, Japan). The content of intracellular ROS was estimated in a suspension of mouse liver cells (3×106 cells/ml). The concentration of malondialdehyde (MDA) was determined in mouse liver homogenate using a UV-1700 spectrophotometer (Shimadzu, Japan) by staining the solution at λ = 535 nm with trimethine complex. As a result of the experiments, we did not find any significant differences from the negative control of all the studied parameters in the mice from group II. Thus, in group II, the frequency of PCE with micronuclei was 0.41±0.080 %, the number of mtDNA damages in the 12S-16S and ND5 fragments was 0.0±0.92 and 2.2±0.45, respectively. The introduction of MMC in group V led to an increase in the frequency of PCE with micronuclei in the bone marrow of mice to 11.20±1.000 %. The number of mtDNA damages in the liver increased to 4.1±0.44 and 4.2±0.30 in the 12S-16S and ND5 fragments, which was accompanied by an increase in the content of intracellular ROS to 314.0±44.20 r.u. and the MDA concentration — to 1.7±0.15 mmol/g. In this case, the course administration of HCBS together with MMC (group III) reduced the frequency of PCE with micronuclei by 27.4 % (p < 0.05) to 8.20±1.070 %, as well as the mtDNA damages by 89.7 % (p < 0.05) in the 12S-16S fragment to 0.4±1.27 compared to the positive control. The changes revealed in group III could be partially due to the observed decrease in the content of intracellular ROS by 58.1 % (p < 0.005) to 131.7±9.84 r.u. and the concentration of MDA by 58.6 % (p < 0.005) to 0.7±0.08 μmol/g in the liver of mice vs. the positive control. These data indicate that the hydrophilic cryofraction of bovine spleen has antimutagenic and DNA-protective properties, which are probably due to its antioxidant action caused by the activation of antioxidant defense systems.
Keywords: hydrophilic cryofraction of bovine spleen, mutagenicity, antimutagenic effect, DNA damage, mitochondrial DNA, mitomycin, micronucleus test, free radical oxidation, mice.
ФГБНУ Всероссийский научно-исследовательский |
Поступила в редакцию |
