doi: 10.15389/agrobiology.2024.6.1221rus
УДК 619:636.2:577.21:579.62
Работа выполнена в рамках гранта РФФИ и Свердловской области № 20-416-660004 «Молекулярно-генетическая и фенотипическая характеристика микробиоты репродуктивной системы крупного рогатого скота».
ГЕНЫ АНТИБИОТИКОРЕЗИСТЕНТНОСТИ, ПАТОГЕННОСТИ И ВИРУЛЕНТНОСТИ Staphylococcus aureus И Escherichia coli, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ РЕПРОДУКТИВНОГО ТРАКТА И МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ КОРОВ (Bos taurus) ПРИ ВОСПАЛЕНИИ
О.В. СОКОЛОВА ✉, В.Д. ЗУБАРЕВА, Н.А. БЕЗБОРОДОВА,
М.В. БЫТОВ, И.А. ШКУРАТОВА
Маститы и метриты — основные заболевания, наносящие молочному скотоводству значительный экономический ущерб, который связан со снижением фертильности и продуктивности, преждевременной выбраковкой высокопродуктивных коров, а также затратами на диагностику и лечение больных животных. В настоящей работе нами впервые проведено генотипирование по генам антибиотикорезистентности, патогенности, вирулентности изолятов Staphylococcus aureus и Escherichia coli, выделенных от крупного рогатого скота на территории Свердловской области. Отмечено наличие изолятов с комбинацией генов, детерминирующих резистентность к антибиотикам и одновременное проявление патогенных и вирулентных свойств. Выявлено, что высокая частота встречаемости генов вирулентности fimA и fimH может иметь важное значение при колонизации E. coli эпителиальных клеток молочной железы и репродуктивного тракта коров. Нашей целью стало изучение генетического профиля изолятов Staphylococcus aureus и Escherichia coli по генам, отвечающим за резистентность к антибактериальным препаратам группы фторхинолонов, цефалоспоринов 2-го поколения, макролидов, аминогликозидов, амфениколов, тетрациклинов, оксазолидинонов, гликопептидов, а также по генам патогенности и вирулентности S. aureus (sea, seb, sec, seg, tst, luks-PV, lukED, fnbA, fnbB, cna) и E. coli (K99, fimA, fimH, F41, Sta, STΙa, STΙb, stx1, stx2). Объектом исследования, выполненного в 2021 году, были изоляты E. coli (n = 26) и S. aureus (n = 16),выделенные из проб секрета молочной железы и цервико-вагинальных смывов от 29 коров голштинской породы с признаками воспалительного процесса репродуктивного тракта и молочной железы. При микробиологическом исследовании использовали готовые питательные среды: среду Эндо (ФБУН ГНЦ ПМБ), солевой бульон, желточно-солевой агар, элективную солевую среду (агар маннит-солевой) (ООО «BioMedia», Россия), хромогенную среду для E. coli, агар хромогенный для уропатогенных бактерий («Condalab», Испания), двухсахарный агар по Росселю («HiMedia Laboratories Private Limited», Индия). ДНК выделяли с помощью тест-системы для выделения ДНК бактерий Рибо-сорб (ООО «ИнтерЛабсервис», Россия). Чувствительность изолятов к антимикробным препаратам определяли диско-диффузионным методом. Использовали диски с антибиотиками известной концентрации: цефокситин (30 мкг), ципрофлоксацин (5 мкг), левомицетин (30 мкг), тобрамицин (10 мкг), тигециклин (15 мкг), линезолид (30 мкг) (ООО «НИЦФ», Россия). Тестирование на резистентность к линезолиду диско-диффу-зионным методом проводили только в отношении S. aureus в соответствии с Eucast clinical Breakpoint Tables V.12.0. ПЦР-детекцию генетических маркеров антибиотикорезистентности mecA, blaDHA, blaOXA-48, blaСTX-Mвыполняли в режиме Real-Time с использованием коммерческих наборов компании ООО НПФ «Литех» (Россия) на анализаторе QuantStudio 5 («Thermo Fisher Scientific», США). Для определения генов антибиотикорезистентности mecA, tetM, vanA, blaFOX, blaEBC, blaACC, blaDHA, blaCITM, blaMOX, blaIMP, генов патогенности E. coli (stx1, stx2), а также генов вирулентности E. coli (K99, fimA, fimH, F41, Sta, STIa, STIb) и S. aureus (sea, seb, sec, seg, tst, luks-PV, lukED, fnbA, fnbB, cna) использовали специфические олигонуклеотидные праймеры, синтезированные компанией ООО «ДНК-Синтез» (Россия). По результатам ПЦР рассчитывали относительную долю изолятов, положительных по генам патогенности, вирулентности и анибиотикорезистентности, выраженную в процентах. У 12,5 % изолятов S. aureus c фенотипом антибиотикорезистентности были обнаружены гены lukED, кодирующие лейкоцидины. Гены fnbA/B, кодирующие фибронектин-связывающие белки, обнаружены у S. aureus: fnbA — у 18,75 % изолятов, fnbB — у 12,5% (из секрета молочной железы при мастите), fnbB — у 6,25 % (из репродуктивного тракта при эндометрите). В исследованных изолятах S. aureus выявлены паттерны распространения комбинаций генов антибиотикорезистентности с генами вирулентности и патогенности. Для 6,25 % изолятов из репродуктивного тракта коров была характерна комбинация fnbA/fnbB/ermB. У 12,5 % изолятов из секрета молочной железы обнаружено сочетание lukED/fnbB/fnbA/ermB. В 6,25 % изолятов из секрета молочной железы установлена комбинация ermB/ermC/fnbA. В 100% изолятов E. coli с фенотипом антибиотикорезистентности был детектирован ген fimA, при этом в 88,46 % случаев также обнаружен ген fimH, оба гена кодируют факторы адгезии. У одного изолята E. coli, выделенного из цервико-вагинальных смывов коровы с эндометритом, детектирован ген stx2. Наиболее распространенным сочетанием была комбинация генов fimA/fimH, кодирующих факторы адгезии и регулирующих образование биопленок, она встречалась у 92,31 % изолятов. Присутствие гена адгезина fimA вместе с геном антибиотикорезистентности blaDHA установлено у одного изолята E. coli, выделенного из секрета молочной железы. Комбинация fimA/fimH/blaDHA/blaOXA детектирована у одного изолята E. coli из секрета молочной железы коровы при мастите. Одновременное присутствие 5 генов в комбинации адгезин/цитотоксин/резистентность к антимикробным препаратам — fimA/fimH/stx2/ermA/ermB было обнаружено у одного изолята кишечной палочки, выделенной из цервико-вагинального смыва от коровы с воспалением репродуктивного тракта. Проведенный микробиологический мониторинг имеет важное значение для оценки факторов репродуктивного здоровья животных, выбора средств терапии, прогнозирования изменений микробиоценозов, а также производства качественной и безопасной животноводческой продукции.
Ключевые слова: генетический профиль, антибиотикорезистентность, патогенность, вирулентность, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, репродуктивный тракт, молочная железа, крупный рогатый скот.
O.V. Sokolova ✉, V.D. Zubareva, N.A. Bezborodova, M.V. Bytov,
I.A. Shkuratova
Mastitis and metritis are the main diseases that cause significant economic damage to dairy cattle breeding, which is associated with a decrease in fertility and productivity, premature culling of highly productive cows, as well as the costs of diagnostics and treatment of affected animals. In this work, we have for the first time carried out genotyping of Staphylococcus aureus and Escherichia coli isolates obtained from cattle in the Sverdlovsk region for the genes of antibiotic resistance, pathogenicity, and virulence. The presence of isolates with a combination of genes determining resistance to antibiotics and the simultaneous manifestation of pathogenic and virulent properties was found. It was revealed that a high frequency of fimA and fimH virulence genes may be important for E. coli colonization of epithelial cells of the mammary gland and reproductive tract of cows. The aim of our research was to study the genetic profile of S. aureus and E. coli isolates for genes responsible for antibacterial resistance to drugs of the fluoroquinolone group, second-generation cephalosporins, macrolides, aminoglycosides, amphenicols, tetracyclines, oxazolidinones, glycopeptides, as well as for the pathogenicity and virulence genes of S. aureus (sea, seb, sec, seg, tst, luks-PV, lukED, fnbA, fnbB, cna) and E. coli (K99, fimA, fimH, F41, Sta, STΙa, STΙb, stx1, stx2). E. coli (n = 26) and S. aureus (n = 16) isolates from mammary gland secretion and cervicovaginal swabs of 29 Holstein cows with signs of inflammatory process in the reproductive tract and mammary gland were studied (2021,. Ready-made nutrient media were used for the microbiological study: Endo medium (State Research Center of Applied Microbiology and Biotechnology), salt broth, yolk-salt agar, elective salt medium (mannitol-salt agar) (OOO BioMedia, Russia), chromogenic medium for E. coli, chromogenic agar for uropathogenic bacteria (Condalab, Spain), Russell double sugar agar (HiMedia Laboratories Private Limited, India). DNA was isolated using the Ribosorb test system for bacterial DNA isolation (OOO InterLabservice, Russia). The sensitivity of isolates to antimicrobial drugs was determined by the disk diffusion method. Discs with antibiotics of known concentration of cefoxitin (30 μg), ciprofloxacin (5 μg), chloramphenicol (30 μg), tobramycin (10 μg), tigecycline (15 μg), linezolid (30 μg) (OOO NITsF, Russia) were used. Testing for resistance to linezolid by the disk diffusion method was performed only for S. aureus in accordance with EUCAST Clinical Breakpoint Tables V.12.0. Detection of antibiotic resistance genetic markers mecA, blaDHA, blaOXA-48, blaСTX-M was carried out in Real-time PCR using commercial kits (NPF Litech, Russia) on a QuantStudio 5 analyzer (Thermo Fisher Scientific, USA). To determine the antibiotic resistance genes mecA, tetM, vanA, blaFOX, blaEBC, blaACC, blaDHA, blaCITM, blaMOX, blaIMP, the pathogenicity genes of E. coli (stx1, stx2), as well as the virulence genes of E. coli (K99, fimA, fimH, F41, Sta, STIa, STIb) and S. aureus (sea, seb, sec, seg, tst, luks-PV, lukED, fnbA, fnbB, cna), specific oligonucleotide primers synthesized by OOO DNA-Synthesis (Russia) were used. By the PCR results, iIn 12.5 % of S. aureus isolates with the antibiotic resistance phenotype, the lukED genes encoding leukocidins were detected. The fnbA/B genes regulating fibronectin-binding proteins were detected in S. aureus: fnbA in 18.75 % of isolates, fnbB in 12.5 % (mastitis milk samples), fnbB in 6.25 % (endometritis swab samples). The studied S. aureus isolates showed combinations of antibiotic resistance genes with virulence and pathogenicity genes. The fnbA/fnbB/ermB combination was characteristic of 6.25 % isolates from the reproductive tract of cows. The lukED/fnbB/fnbA/ermB combination was found in 12.5 % isolates from mammary gland secretion. The ermB/ermC/fnbA combination was established in 6.25 % isolates from mammary gland secretion. The fimA gene was detected in 100 % of E. coli isolates with the antibiotic resistance phenotype, while the fimH gene was also detected in 88.46 % of cases; both genes encode adhesion factors. The stx2 gene was detected in one E. coli isolate from cervicovaginal swabs of a cow with endometritis. The most common combination was the fimA/fimH encoding adhesion factors and regulating biofilm formation; it was found in 92.31 % isolates. The fimA adhesin gene combined with the blaDHA antibiotic resistance gene were found in one E. coli isolate from mammary gland secretion. The fimA/fimH/blaDHA/blaOXA combination was detected in one E. coli isolate from mammary gland secretion of a cow with mastitis. The simultaneous presence of 5 genes in the adhesin/cytotoxin/AMP resistance combination fimA/fimH/stx2/ermA/ermB was found in one E. coli isolate from cervicovaginal swab from a cow with inflammation of the reproductive tract. The conducted microbiological monitoring is important for assessing factors of animal reproductive health, choosing rational therapy, and predicting changes in microbiocenoses to ensure high quality and safety of livestock products.
Keywords: genetic profile, antibiotic resistance, pathogenicity, virulence, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, reproductive tract, mammary gland, cattle.
ФГБНУ Уральский федеральный аграрный |
Поступила в редакцию |
