doi: 10.15389/agrobiology.2024.6.1179rus
УДК 636.5:591.16:611.013.11:57.04
Работа выполнена при поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации по теме ГЗ № FGGN-2024-0013.
ОЦЕНКА ЦИТОЛОГИЧЕСКОЙ ЦЕЛОСТНОСТИ И ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ ПОЛНОЦЕННОСТИ ОТТАЯННЫХ СПЕРМАТОЗОИДОВ ПЕТУХОВ (Gallus gallus domesticus L.) ПОД ВОЗДЕЙСТВИЕМ АНТИОКСИДАНТНЫХ КОМПОНЕНТОВ КРИОЗАЩИТНЫХ СРЕД ИНОЗИТОЛА И НАНОЧАСТИЦ ОКСИДА ЦИНКА (НЧ ZnO)
Ю.Л. СИЛЮКОВА ✉, Е.С. ФЕДОРОВА, О.И. СТАНИШЕВСКАЯ
Повреждение сперматозоидов в цикле замораживания-оттаивания приводит к снижению функциональности и уменьшению получаемого потомства. Поэтому обеспечение сохранности цитологической целостности сперматозоидов — обязательное условие для практического использования криоконсервации в репродукции сельскохозяйственной птицы. В представленной работе впервые показано, что при использовании наночастицы ZnO (концентрация 50 мкг/100 мл) в составе криопротекторных сред для замораживания спермы петухов наночастицы могут оказывать контрацептивное действие и снижать функциональность оттаянных сперматозоидов, при этом доказано преимущество использования в составе криозащитных сред инозитола. Целью работы была оценка воздействия антиоксидантов естественного происхождение (инозитол) и/или наночастиц ZnO в составе криопротекторных сред на структурно-функциональное состояние заморожено-оттаянных сперматозоидов петухов. Исследования проводили в 2023 году на петухах (Gallus gallus domesticus L.) русской белой породы яичного направления продуктивности (n = 23) в возрасте 39-44 нед из биоресурсной коллекции Генетическая коллекция редких и исчезающих пород кур (ВНИИГРЖ, г. Санкт-Петербург). Отбор петухов по качеству семени проводили в соответствии с ГОСТ 27267-2017 (М., 2017). Объем эякулята (мл) измеряли градуированной пипеткой, концентрацию сперматозоидов (млрд/мл) — с использованием фотометра (Accuread Photometer, «IMV Technologies», Великобритания), общую подвижность (ОП, %) — на микроскопе Микромед МС-12 («Ningbo Sheng Heng Optics & Electronics Co Ltd.», Китай) при увеличении ×100. Полученные эякуляты объединяли и делили на 4 равные аликвоты (по числу разбавителей), затем разбавляли криопротекторными средами в соотношении 1:1. Использовали следующие криозащитные среды: ЛКС (контроль), Mal20, Mal20 + Inositol (содержание инозитола 11,25 ммоль), Mal20 + НЧ ZnO (размер наночастиц 14 нм; 50 мкг). Образцы замороженного семени хранили в сосудах Дьюара не менее 55 сут. Анализ общей и прогрессивной подвижности сперматозоидов проводили с помощью визуализирующей системы CASA АргусСофт-Poultry («АргусСофт», Россия). Жизнеспособность оценивали методом окрашивания красителем эозин-нигрозин (EN), визуализировали на фазово-контрастном микроскопе Motic BA410E («Motic», Китай) при увеличении ×1000. Определяли целостность акросом сперматозоидов нативного и заморожено-оттаянного семени. При оценке живых клеток и клеток в состоянии апоптоза использовали набор для проточной цитометрии V-AF488 (ООО «Люмипроб РУС», Россия). Для окрашивания активных митохондрий и измерения мембранного потенциала митохондрий в живых клетках использовали митохондриальный маркер Mito TMRE (тетраметилродамин, этиловый эфир; «Lumiprobe», Россия) на проточном цитометре Cytoflex («Beckman Coulter, Inc.», США). При определении содержания внутриклеточного АФК (H2O2) в живых сперматозоидах использовали набор для проточной цитометрии H2DCFDA (2',7'-дихлородигидрофлуоресцеин диацетат) (ООО «Люмипроб РУС», Россия). Интенсивность флуоресценции оттаянных сперматозоидов определяли с помощью платформы Flow Cytometry Analysis (https://floreada.io/). Фертильность заморожено-оттаянного семени оценивали с помощью искусственного осеменения кур. Формировали 3 группы кур (не менее 15 гол. в каждой), осеменяли 3 раза по схеме: 2 сут подряд и через 1 сут. Для осеменения использовали сперму, замороженную в средах ЛКС (контроль), Mal20 + Inositol, Mal20 + НЧ ZnO. Использование среды Mal20 + Inositol позволило повысить жизнеспособность оттаянных сперматозоидов на ~ 4 % (p < 0,05), целостность акросом — на ~ 5 %. Использование НЧ ZnO позволило повысить целостность акросом на ~ 32 % (p < 0,01); влияние на жизнеспособность было отрицательным (-4,3 %). Содержание H2O2 в оттаянных сперматозоидах, которые были заморожены в среде Mal20 + НЧ ZnO, оцененное по показателю медианного значения интенсивности флуоресценции (FI), было на 9,2 % меньше, чем у клеток, замороженных с ЛКС (контроль). Показатели оплодотворенности яиц после осеменения оттаянным семенем с НЧ ZnO были критически низкими 2,5-8,8 %, тогда как при использовании инозитола составляли 73,8-77,9 %, что было на ~ 10 % выше контроля. Таким образом, применение антиоксидантов различной природы в составе криопротекторных сред может оказывать неоднозначное влияние на сохранность субклеточных структур оттаянных сперматозоидов. Полученные результаты свидетельствуют о перспективности использования комбинации сахаридов (фруктоза и мальтоза) и полиола (инозитол) в составе криозащитных сред для семени петухов.
Ключевые слова: сперматозоиды, антиоксиданты, инозитол, наночастицы оксида цинка, АФК, криоконсервация, фертильность.
Yu.L. Silyukova ✉, E.S. Fedorova, O.I. Stanishevskaya
Damage to spermatozoa during the freeze-thaw cycle leads to reduced functionality and a decrease in the number of offspring produced. Therefore, ensuring the preservation of cytological integrity of spermatozoa is a prerequisite for the practical use of cryopreservation in poultry reproduction. In the presented work it is shown for the first time that when ZnO nanoparticles (NP) (concentration 50 µg/100 ml) are used in the composition of cryoprotective media for freezing the semen of roosters, nanoparticles can have a contraceptive effect and reduce the functionality of thawed spermatozoa, and the advantage of using inositol in the composition of cryoprotective media is proved. The aim of this work was to evaluate the effect of antioxidants of natural origin (inositol) and/or NP ZnO in cryoprotective media on the structural and functional state of frozen-thawed rooster spermatozoa. Studies were carried out in 2023 on roosters (Gallus gallus domesticus L.) of Russian White egg laying chicken breed (n = 23) at the age of 39-44 weeks from the bioresource collection Genetic Collection of Rare and Endangered Breeds of Chickens (RRIFAGB, St. Petersburg). Selection of roosters by seed quality was carried out in accordance with GOST 27267-2017 (M., 2017). The volume of ejaculate (ml) was measured with a graduated pipette, sperm concentration (billion/ml) was measured using a photometer (Accuread Photometer, IMV Technologies, UK), and total motility (%) was measured using a Micromed MS-12 microscope (Ningbo Sheng Heng Optics & Electronics Co Ltd., China) at a magnification of ×100. The obtained ejaculates were pooled and divided into 4 equal aliquots (according to the number of diluents), then diluted with cryoprotective media in a 1:1 ratio. The following cryoprotective media were used: LCM (control), Mal20, Mal20 + Inositol (inositol content 11.25 mmol), Mal20 + ZnO NPs (NP size 14 nm; 50 μg). Frozen semen samples were stored in Dewar vessels for at least 55 days. Total and progressive sperm motility were analysed using the CASA ArgusSoft-Poultry imaging system (ООО ArgusSoft, Russia). Viability was assessed by staining with eosin-nigrosin (EN) dye and visualised on a Motic BA410E phase-contrast microscope (Motic, China) at a magnification of ×1000. The acrosome integrity of spermatozoa from native and frozen-thawed semen was determined. V-AF488 flow cytometry kit (ООО Lumiprobe RUS, Russia) was used to assess live cells and cells in the state of apoptosis. The mitochondrial marker Mito TMRE (tetramethylrhodamine, ethyl ester; ООО Lumiprobe RUS, Russia) was used on a Cytoflex flow cytometer (Beckman Coulter, Inc., USA) to stain active mitochondria and measure the mitochondrial membrane potential in living cells. The H2DCFDA (2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate) flow cytometry kit (ООО Lumiprobe RUS, Russia) was used to determine the content of intracellular ROS (H2O2) in live spermatozoa. The fluorescence intensity of thawed spermatozoa was determined using the Flow Cytometry Analysis platform (https://floreada.io/). Fertility of frozen-thawed semen was evaluated by artificial insemination of hens. Three groups of hens (at least 15 hens in each group) were formed, inseminated 3 times according to the scheme: two consecutive days and after 1 day. Semen frozen in LCM (control), Mal20 + Inositol, Mal20 + NP ZnO was used for insemination. The use of Mal20 + Inositol medium increased the viability of thawed spermatozoa by ~ 4 % (p < 0.05), acrosome integrity by ~ 5 %. Egg fertilization rates after insemination with thawed semen with NP ZnO were critically low, 2.5-8.8 %, whereas with inositol they were 73.8-77.9 % (~ 10 % higher compared to the control). Thus, the use of antioxidants of different nature in the composition of cryoprotective media can have an ambiguous effect on the preservation of subcellular structures of thawed spermatozoa. The results obtained indicate the promising use of a combination of saccharides (fructose and maltose) and polyol (inositol) in the composition of cryoprotective media for rooster sperm.
Keywords: spermatozoa, antioxidants, inositol, zinc oxide nanoparticles, ROS, cryopreservation, fertility.
Всероссийский НИИ генетики и разведения |
Поступила в редакцию |
