doi: 10.15389/agrobiology.2024.6.1237rus
УДК 619:579.62:577.21
РАЗРАБОТКА ТЕСТ-СИСТЕМ ПЦР В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ДНК Mycoplasma bovis И Mycoplasma bovigenitalium
М. АБЕД АЛХУССЕН, А.О. КРОТОВА, О.Е. ФЕДОРОВА,
В.М. ЗАХАРОВ, Т.В. ЖБАНОВА, О.П. БЬЯДОВСКАЯ, А.В. СПРЫГИН ✉
В настоящее время возбудители микоплазмоза крупного рогатого скота (КРС), вызванного Mycoplasma bovis и M. bovigenitalium, распространены в животноводческих хозяйствах во всем мире, в том числе и в Российской Федерации. Микоплазмозы КРС характеризуются поражением верхних дыхательных путей, серозно-катаральным воспалением легких, артритами, ринитами, пневмониями у молодняка, абортами у беременных животных, вульвовагинитами, маститами и рождением мертвого или нежизнеспособного плода. Экономический ущерб складывается из падежа, вынужденного убоя, недополучения живой массы и потомства, затрат на лечение, профилактику. Разработка методов выявления указанных возбудителей имеет большое значение для контроля микоплазменной инфекции. В настоящем сообщении предлагается тест-система для выявления геномов M. bovis и M. bovigenitalium с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (с подтвержденной эффективностью, специфичностью и высокой аналитической чувствительностью), разработка которой была целью нашего исследования. Мы провели анализ геномных последовательностей M. bovis и M. bovigenitalium из базы данных GenBank (NCBI) и выбрали локус fusA для M. bovis и межгенное пространство генов 16S-23S рРНК для M. bovigenitalium. Определены оптимальные концентрации компонентов реакционной смеси: хлорида магния — 5,5 мМ для M. bovis и 6,0 мМ для M. bovigenitalium, дезоксинуклеозидтрифосфатов — 300 мкМ для M. bovis и 200 мкМ для M. bovigenitalium, праймеров — 0,4 мкМ для M. bovis и 0,3 мкМ для M. bovigenitalium, флуоресцентных зондов — 0,05 мкМ для M. bovis и 0,15 мкМ для M. bovigenitalium, а также подобран следующий температурно-временной режим реакции для M. bovis и M. bovigenitalium: 10 мин при 95 °С (прогрев реакционной смеси), далее 40 циклов ПЦР, состоящих из денатурации ДНК в течение 10 с при 95 °С, отжига праймеров и элонгации кДНК в течение 60 с при 60 °С. Установлены высокая аналитическая специфичность предложенных тест-систем: предел обнаружения ДНК микоплазм составил 25-50 КОЕ/мл при эффективности амплификации 90,94 и 91,85 % соответственно для M. bovis и M. bovigenitalium. При применении разработанных нами методик для тестирования 1342 проб биоматериала от КРС с клиническими признаками репродуктивной и/или респираторной патологии, проанализированных ранее с использованием других методических подходов, показано полное совпадение результатов. Таким образом, на основе полимеразной цепной реакции в режиме реального времени нами разработаны специфичные, высокочувствительные и воспроизводимые тест-системы для выявления ДНК M. bovis и M. bovigenitalium прирутинной диагностике микоплазмоза крупного рогатого скота.
Ключевые слова: Mycoplasma bovis, Mycoplasma bovigenitalium, полимеразная цепная реакция в режиме реального времени, qPCR, чувствительность, специфичность, эффективность амплификации.
M. Abed Alhussen, A.O. Krotova, O.E. Fedorova, V.M. Zakharov,
T.V. Zhbanova, O.P. Byadovskaya, A.V. Sprygin ✉
Currently, the causative agents of cattle mycoplasmosis caused by Mycoplasma bovis and M. bovigenitalium are prevalent in livestock farms all over the world, including the Russian Federation. Clinical signs observed in cattle mycoplasmosis are upper respiratory tract infection, serous catarrhal inflammation of the lungs, arthritis, rhinitis, pneumonia in young cattle, abortions in pregnant animals, vulvovaginitis, mastitis and birth of dead or non-viable litter. The economic damage includes mortality, involuntary slaughter, loss of live weight and offspring, treatment costs, prevention, etc. In this regard, the development of methods for detection of these pathogens is of high significance for the control of mycoplasma infection. This study is aimed at the development and optimization of methods for detection of M. bovis and M. bovigenitalium genomes using real-time polymerase chain reaction. For this purpose, we analyzed the genetic sequences of the GenBank database and selected the fusA locus for M. bovis and the 16S-23S rRNA locus for M. bovigenitalium. The optimum concentrations of the reaction components: magnesium chloride 5.5 mM for M. bovis and 6.0 mM for M. bovigenitalium, deoxynucleoside triphosphates 300 mM for M. bovis and 200 mM for M. bovigenitalium, primers 0.4 mM for M. bovis and 0.3 mM for M. bovigenitalium, fluorescent probes 0.05 mM for M. bovis and 0.15 mM for M. bovigenitalium; the temperature and time conditions for M. bovis and M. bovigenitalium were as follows: 10 min at 95 °С (reaction mixture heating), then 40 PCR cycles consisting of DNA denaturation for 10 s at 95 °С, primer annealing and cDNA elongation for 60 s at 60 °С. A high analytical specificity, detection limit of mycoplasma DNA, which was 25-50 CFU/ml, and amplification efficiency of 90.94 and 91.85% for M. bovis and M. bovigenitalium, respectively, were established. Therefore, as a result of these studies, specific and reproducible test systems based on real-time polymerase chain reaction for detection of M. bovis and M. bovigenitalium DNA for routine diagnosis of bovine mycoplasmosis have been developed.
Keywords: Mycoplasma bovis, Mycoplasma bovigenitalium, real-time polymerase chain reaction, qPCR, sensitivity, specificity, amplification efficiency.
ФГБУ Федеральный центр охраны здоровья животных, |
Поступила в редакцию |
