doi: 10.15389/agrobiology.2020.6.1182rus
УДК 637.03:573.6.086.83.001.26
При проведении протеомного исследования использовалось оборудование ЦКП ФИЦ Биотехнологии РАН (идентификатор RFMEFI62114Х0002). Исследование профинансировано за счет гранта РНФ (проект № 16-16-10073П).
ОБРАЗОВАНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ПЕПТИДОВ
В МЯСНОМ СЫРЬЕ ПОД ВЛИЯНИЕМ ЛИЗАТОВ СТАРТОВЫХ
БАКТЕРИАЛЬНЫХ КУЛЬТУР
И.М. ЧЕРНУХА1, Н.Г. МАШЕНЦЕВА1 ✉, Н.Л. ВОСТРИКОВА1, Л.И. КОВАЛЕВ2, М.А. КОВАЛЕВА2, Д.А. АФАНАСЬЕВ3
В настоящее время препараты, основанные на лизатах бактерий, используются главным образом в медицине. В пищевых производствах, в том числе в мясной промышленности при получении функциональных продуктов, бактериальные лизаты пока что мало распространены. Их перспективность для получения функциональных продуктов предсказуема, но эффективность и специфичность действия, которые зависят от особенностей штамма и метода дезинтеграции клеток, требует изучения. У стартовых культур идентифицирован набор пептидаз, в частности эндопептидазы, аминопептидазы, дипептидазы, трипептидазы и пролинспецифические пептидазы, что стимулирует интерес к применению лизатов этих микроорганизмов в пищевых биотехнологиях. В настоящей работе мы показали, что лизаты штаммов Pediococcus pentosaceus 28, Staphylococcus carnosus 108, Lactobacillus curvatus 1, P. acidilactici 38, L. sakei103, L. sakei 105, L. curvatus 2 и L. acidophilus AT-41, полученные при физическом разрушении клеток, обладают наиболее широкими спектрами ферментов и биологически активных веществ. Нашей целью было определение биохимического состава и ферментативной активности лизатов стартовых бактериальных культур и их роли в образовании биологически активных пептидов в мясном сырье. Рассмотрены два способа получения лизатов из клеток стартовых культур — ферментативный и физический. Первый способ заключается в ферментативной обработке суспензии бактериальных клеток ферментом лизоцимом с последующим отделением экстракта от клеточного дебриса путем центрифугирования, второй — в ультразвуковой обработке. По результатам исследований было выявлено, что наиболее эффективным является физический способ лизиса. Проведена комплексная оценка полученных лизатов — определены протеолитическая, липолитическая и коллагеназная активности, содержание органических кислот, концентрация белка и количество свободных аминокислот. С применением тест-систем API®ZYM определены ферментативные активности лизатов, характерные для использованных видов микроорганизмов. Наиболее широкий спектр внутриклеточных ферментов, а именно лейциновая и валиновая ариламидаза, кислая фосфатаза, нафтол-AS-BI-фосфогидролаза и b-галактозидаза, представлен в лизатах штаммов L. curvatus 2, L. acidophilus AT-41, P. acidilactici 38 и S. carnosus 108. Наибольшую протеолитическую активность выявили в лизатах штаммов S. carnosus 108 (115,94 ед. ПС/мг белка), L. acidophilus AT-41 (66,7 ед. ПС/мг белка), L. curvatus 1 (91,03 ед. ПС/мг белка) и L. curvatus 2 (72,20 ед. ПС/мг белка). Содержание яблочной, молочной и янтарной кислот в лизатах варьировало в пределах соответственно 0,002-0,02; 0,02-0,06 и 0,2-0,9 мг/100 г образца. Наиболее широкий спектр свободных аминокислот представлен в образце лизата из P. acidilactici 38 (13 из 17 исследуемых аминокислот), узкий спектр — в образце лизата из L. sakei 105 (7 из 17 исследуемых аминокислот). Сравнительный анализ полученных двумерных электрофореграмм ферментированного мясного сырья показал как общее действие (снижение количества белкового материала), так и специфичность влияния лизатов на ряд белков в зависимости от используемого лизата стартовой культуры (белки-мишени, в частности актин скелетной мышцы, образование белковых конъюгатов). Полученные данные позволяют рассматривать лизаты стартовых культур как источник ряда ферментов для практического применения в пищевой промышленности (например, для повышения функционально-технологических и биокоррегирующих характеристик мясных продуктов).
Ключевые слова: лизаты, стартовые культуры, ферментолиз, биологически активные пептиды, двумерный электрофорез, IEF-PAGE, MALDI-TOF, масс-спектрометрическая идентификация.
I.M. Chernukha1, N.G. Mashentseva1 ✉, N.L. Vostrikova1, L.I. Kovalev2, M.A. Kovaleva2, D.A. Afanasev3
Nowadays, preparations based on bacterial lysates are mainly applied in medicine. In food industry, bacterial lysates are still not widely used, in particular for manufacturing meat functional foodstuff. Though their potential for functional foodstuff production is predictable, the efficiency and specificity of action which depend on the characteristics of the strain and the method of cell disintegration require study. A set of peptidases identified in starter cultures, in particular endo-peptidases, aminopeptidases, dipeptidases, tripeptidases, and proline-specific peptidases stimulate interest in the lysates of these microorganisms for food biotechnology. In this work, we have shown that lysates of Pediococcus pentosaceus 28, Staphylococcus carnosus 108, Lactobacillus curvatus 1, P. acidilactici 38, L. sakei 103, L. sakei 105, L. curvatus 2, L. acidophilus AT-41 that we obtained by physical destruction of bacterial cells have the widest spectrum of enzymes and biologically active substances. Our goal was to determine the biochemical composition and enzymatic activity of the lysates of starting bacterial cultures and their role in the formation of biologically active peptides in raw meat. The bacterial suspensions were exposed either to lysozyme treatment followed by separation of the extract from the cell debris by centrifugation, or to ultrasonic treatment to compare two methods of cell destruction. The physical method was proved to be the most effective. For biochemical characterization, the proteolytic, lipolytic and collagenase activities of the lysates, and the concentration of organic acids, proteins, and free amino acids were measured. Enzymatic activities of the lysates were determined using API®ZYM tests. The Lactobacillus curvatus 2, Lactobacillus acidophilus AT-41, Pediococcus acidilactici 38 and Staphylococcus carnosus 108 lysates showed the widest range of intracellular enzymes, including leucine and valine arylamidase, acid phosphatase, naphthol-AS-BI-phosphohydrolase, and b-galactosidase. The proteolytic activity was the highest in Staphylococcus carnosus 108 (115.94 proteolytic capability PC units per mg protein), Lactobacillus acidophilus AT-41 (66.7 PC units per mg protein), Lactobacillus curvatus 1 (91.03 PC units per mg protein), and Lactobacillus curvatus 2 (72.20 PC units per mg protein) as compared to other strains. The level of malic, lactic and succinic acids in the lysates varied in the range of 0.002-0.02, 0.02-0.06, and 0.2-0.9 mg/100 g, respectively. The highest enrichment in free amino acids with 13 AA detected out of 17 AA studied was characteristic of P. acidilactici 38 lysate while only 7 AA were detected in the L. sakei 105 lysate. A comparison of 2D electrophoregrams of fermented raw meat showed both general effects on reducing total proteins and the lysate-specific effects toward various proteins, e.g. formation of protein conjugates and cleavage of target proteins, in particular actin skeletal muscle. Therefore, lysates of the studied starter cultures can serve as a source of various enzymes for practical use in the food industry, for example to improve the functional, technological and biocorrective characteristics of meat products.
Keywords: lysates, starting cultures, enzymatic lysis, biologically active peptides, two-dimensional electrophoresis, IEF-PAGE, MALDI-TOF, mass spectrometry.
1ФГБНУ ФНЦ пищевых систем им. В.М. Горбатова РАН, |
Поступила в редакцию |
