БИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ
БИОЛОГИЯ ЖИВОТНЫХ
ПЕЧАТНАЯ ВЕРСИЯ
ЭЛЕКТРОННАЯ ВЕРСИЯ
 
КАК ПОДАТЬ РУКОПИСЬ
 
КАРТА САЙТА
НА ГЛАВНУЮ

 

 

 

 

doi: 10.15389/agrobiology.2019.6.1206rus

УДК 636.2:591.39

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (проект 17-29-08035) и Министерства науки и высшего образования РФ.

 

ДОЗРЕВАНИЕ ООЦИТОВ КОРОВ В СРЕДЕ FERT-TALP ПОВЫШАЕТ ИХ КАЧЕСТВО И КОМПЕТЕНТНОСТЬ К РАЗВИТИЮ in vitro

Г.Н. СИНГИНА, Е.Н. ШЕДОВА

Экстракорпоральное созревание (in vitro maturation, IVM) — важный этап получения эмбрионов in vitro (in vitro embryo production, IVP). Условия среды, окружающей ооциты вне организма, критически влияют на качество яйцеклеток, что делает эти условия объектом направленного воздействия. Чаще всего для IVM ооцитов коров используется однофазное культивирование в среде ТС-199, дополненной фетальной бычьей сывороткой (ФБС) и гонадотропными гормонами. Дифференцированное созревание, учитывающее асинхронность между ядерными и цитоплазматическими преобразованиями в ооцитах, следует рассматривать в качестве альтернативного и более естественного подхода к получению IVP эмбрионов. В настоящем исследовании впервые проведено сравнение двухфазных IVM протоколов, предполагающих созревание ооцитов коров на начальном этапе в стандартной среде и на завершающем этапе — в одной из двух сред без гормонов (ТС-199 и Fert-TALP — среды, традиционно используемой на последующем этапе оплодотворения). Цель представленной работы заключалась в изучении влияния тестируемых условий на состояние хромосом и степень апоптотической дегенерации в созревающих ооцитах, а также на развитие и качество IVP эмбрионов. Ооцит-кумулюсные комплексы (ОКК) созревали в течение 16 ч в среде ТС-199, дополненной 10 % ФБС, 10 мкг/мл фолликулостимулирующего (ФСГ) и 10 мкг/мл лютеинизирующего (ЛГ) гормонов. Затем ОКК переносили в среду ТС-199, содержащую только сыворотку (1-я система), либо в среду Fert-TALP (2-я система) и культивировали еще в течение 8 ч. Часть созревших ооцитов использовали для анализа состояния ядерного материала (окрашивание DAPI) и степени апоптоза (метод TUNEL). Другую часть подвергали оплодотворению для оценки компетенции к эмбриональному развитию. Цитологический анализ не выявил влияния системы культивирования на завершение ядерного созревания. Доля МII ооцитов через 24 ч созревания была сходной в обеих группах и составляла в 1-й и 2-й системе соответственно 83,3 и 84,7 %. В то же время процент ооцитов с признаками апоптоза при их дозревания во 2-й системе был ниже (11,7±0,7 %), чем в 1-й системе (19,4±1,1) (p < 0,05). Также обнаружено влияние условий созревания ооцитов на их развитие до стадии бластоцисты после оплодотворения in vitro. В случае переноса ОКК спустя 16 ч культивирования в среду ТС-199 выход бластоцист составлял 17,4±0,4 %. Использование в соответствующий период культивирования среды Fert-TALP повышало этот показатель до 30,0±2,9 % (p < 0,05). При этом не было обнаружено различий между сравниваемыми вариантами по доле (%) начавших дробление, общему числу ядер и степени апоптоза в бластоцистах. Полученные данные свидетельствуют о том, что при двухфазном IVM культивирование ооцитов во вторую фазу созревания (8 ч) в среде Fert-TALP более предпочтительно, чем в среде ТС-199, содержащей ФБС. Использование указанных условий понижает апоптоз в зрелых ооцитах и повышает их способность к эмбриональному развитию после оплодотворения in vitro.

Ключевые слова: ооциты коров, культивирование in vitro, среды созревания, апоптоз, эмбриональное развитие.

 

 

FINAL MATURATION OF BOVINE OOCYTES IN A FERT-TALP MEDIUM INCREASED THEIR QUALITY AND COMPETENCE TO IN VITRO EMBRYO DEVELOPMENT

G.N. Singina, E.N. Shedova

In vitro maturation (IVM) of the oocytes is an important step for in vitro embryo production (IVP). In vitro culture during maturation decreases oocyte quality and therefore, IVM conditions need to be improved. Routinely, IVM of bovine oocytes is performed using one-step medium, the TC-199 complemented with fetal bovine serum (FBS) and gonadotropins. However, the asynchrony of oocyte nuclear and cytoplasm maturation processes may require the differential hormonal environment during IVM. In the present work, for the first time we have compared the efficiency of the two-step IVM protocols, which include the first step in standard conditions and final maturation in hormone-free mediums TC-199 or Fert-TALP; the last one is a routine medium for in vitro fertilization (IVF). The objective was to study the effects of two-step IVM protocols to chromosome modifications and apoptotic events in mature oocytes and a quality of in vitro produced embryos. Oocyte-cumulus cells complexes (ОСС) were in vitro matured during 16 h in medium TC-199 complemented with 10 % FBS, 10 mg/ml follicle-stimulating hormone and 10 mg/ml luteinizing hormone, and then transferred to either medium TC-199 without gonadotropins (System 1) or Fert-TALP medium (System 2) for additional 8 h of IVM. After final IVM, nuclear state and apoptosis were checked in a part of the mature oocytes. IVF was performed on remaining OCC to analyze in vitro embryo development. No difference was observed in nuclear maturation rates between the systems 1 and 2 after 24 h IVM: 83.3 % and 84.7 % of the oocytes reached metaphase-II. Apoptosis rate were significantly lower (p < 0.05) in the oocytes matured in System 2 (11.7±0.7 %) compared to System 1 (19.4±1.1 %). In addition, blastocyst rate after 7 days of in vitro embryo development was significantly higher (p < 0.05) in System 2 (30.0±2.9 %), than in System 1(17.4±0.4 %). Oocyte cleavage rate, cell number and apoptosis rate in the blastocysts were similar in both IVM systems. In conclusion, two-step IVM system using final 8-hour maturation in Fert-TALP medium is more advantageous compared to a system including hormone-free TC-199 medium at the end of IVM. Fert-TALP IVM system decreased apoptosis rate in the oocytes and increased their competence to in vitro embryo development after IVF.

Keywords: bovine oocytes, in vitro maturation, maturation media, apoptosis, embryo development.

 

ФГБНУ ФНЦ животноводства
ВИЖ им. академика Л.К. Эрнста,
142132 Россия, Московская обл., г.о. Подольск, пос. Дубровицы, 60,
e-mail: g_singina@mail.ru ✉, shedvek@yandex.ru

Поступила в редакцию
17 сентября 2019 года

 

назад в начало

 


СОДЕРЖАНИЕ

 

 

Полный текст PDF

Полный текст HTML