БИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ
БИОЛОГИЯ ЖИВОТНЫХ
ПЕЧАТНАЯ ВЕРСИЯ
ЭЛЕКТРОННАЯ ВЕРСИЯ
 
КАК ПОДАТЬ РУКОПИСЬ
 
КАРТА САЙТА
НА ГЛАВНУЮ

 

 

 

 

doi: 10.15389/agrobiology.2019.6.1290rus

УДК 579.6:577.15

Работа выполнена в рамках проекта № 0710-2017-0010 «Поиск живых систем и субстанций природного происхождения с анализом их биологической активности для создания функциональных продуктов питания и кормов».

 

УФ-ИНДУЦИРОВАННЫЙ ДРОЖЖЕВОЙ ПРОДУЦЕНТ ЛИПАЗЫ С ШИРОКОЙ СУБСТРАТНОЙ СПЕЦИФИЧНОСТЬЮ — СЕЛЕКЦИЯ, СВОЙСТВА И ПОЛУЧЕНИЕ ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА

Е.Ф. ГАСКАРОВА, Л.А. ИВАНОВА, Л.А. ЧУРМАСОВА, Н.Г. МАШЕНЦЕВА, Д.Л. КЛАБУКОВА

Липазы, изменяющие количественные и/или качественные характеристики жиросодержащего сырья, широко применяются при решении разнообразных задач в современной пищевой и агропромышленной отраслях. Для обеспечения растущих потребностей в препаратах этих ферментов необходимы высокоэффективные продуценты, особенно проявляющие множественную активность в отношении жиров различного состава и происхождения. Цель работы заключалась в поиске нового высокоактивного дрожжевого продуцента липазы с широкой субстратной специфичностью и оптимизация условий его культивирования. Также в настоящем исследовании получен ферментный препарат, обеспечивающий высокую степень гидролиза различных масел, и охарактеризованы его технологические свойства. У 110 изолятов дрожжевых культур, выделенных из природных источников и полученных из коллекций ФГБОУ ВО МГУПП и ФГБУ ГосНИИгенетика, были изучены липолитические свойства. Качественное определение липазной активности осуществляли на дифференциальной питательной среде с трибутирином и красителем метиловым красным, количественное — в соответствии с модифицированным методом Y. Ota и K. Yamada при pH реакционной смеси 5,5. Из 23 штаммов, обладавших липолитической активностью (ЛА), 12 имели достаточно высокие показатели ЛА — от 2,5 до 7,5 Ед/см3. Из них выбрали изолят М10 с максимальной ЛА. Были изучены морфологические, культуральные и физиолого-биохимические особенности штаммов и выполнена молекулярно-генетическая идентификация высокоактивного изолята. С помощью филогенетического анализа штамм был идентифицирован как Candida parapsilosis (степень гомологии 99 %) и депонирован во Всероссийскую коллекцию промышленных микроорганизмов (ВКПМ ФГБУ ГосНИИгенетика) под номером Y-4055. После проведения УФ-мутагенеза получен высокоактивный мутант C. parapsilosis М10-10, и с применением методов математического планирования подобран состав питательной среды (ПС), оптимальный для культивирования продуцента и биосинтеза фермента (%): горчичное масло — 2,6; дрожжевой экстракт — 1,8; соевая мука — 1; глюкоза — 0,5; Tween 80 — 0,42; СаСО3 — 0,3; КН2РО4 — 0,03; MgSO4·7H2O — 0,02. Установлено, что при использовании посевного материала М10-10 в количестве 5 % от объема ПС липаза достигает наибольшей активности в культуральной жидкости к 48 ч ферментации. При глубинном культивировании штамма М10-10 при температуре 30-40 °С и рН питательной среды 5,5-6,5 получен ферментный препарат (ФП) липазы штамма М10-10 со степенью очистки Г20×, ЛА которого составила 30630 Ед/г. Определены оптимальные условия для действия ФП: температура 37 °С и рН 5,5. По активности полученный ФП не уступает коммерческим отечественными и зарубежными аналогам, в том числе препарату Novozym 435 («Sigma-Aldrich», США), имеющему ЛА 24020 Ед/г. Жирнокислотную специфичность препарата липазы определяли при ферментолизе различных растительных масел и анализе липидных продуктов методом газожидкостной хроматографии на хроматографе ShimadzuGC 2010 («Shimadzu», Япония). Модификация растительных масел ферментным препаратом липазы М10-10 Г20× в эмульсии масло/вода позволила достоверно снизить относительное содержание насыщенных жирных кислот (в том числе пальмитиновой и стеариновой) в 2,4; 4,6; 2,9 и 1,5 раза и увеличить относительное содержание полиненасыщенных жирных кислот (в том числе w-3 линоленовой и w-6 линолевой) в 1,5; 1,6; 1,1 и 12 раз соответственно для оливкового, горчичного, подсолнечного и кокосового масел.

Ключевые слова: Candida parapsilosis M10-10, продуцент липазы, ферментный препарат, УФ-мутагенез, условия ферментации, липолитическая активность, модификация растительных масел, насыщенные жирные кислоты, ненасыщенные жирные кисоты.

 

 

UV-INDUCED YEAST LIPASE PRODUCER WITH A WIDE SUBSTRATE SPECIFICITY – SELECTION, CHARACTERIZATION AND PRODUCTION OF THE ENZYME

E.F. Gaskarova, L.A. Ivanova, L.A. Churmasova, N.G. Mashentseva,
D.L. Klabukova

Lipases are capable of changing the quantitative and/or qualitative characteristics of fat-containing raw materials and widely used for various tasks in modern food and agricultural industries. To meet the growing demand for these enzymes, highly effective producers are needed, especially those exhibiting multiple activity to lipids of different structure and origin. The aim of the study was to search for a new yeast strain with high production of lipase with broad substrate specificity, and to optimize its fermentation conditions. This work objectives also included obtaining an enzyme with a high grade of hydrolysis of various oils, and the study of its technological properties. Lipolytic characteristics were studied in 110 yeast isolates obtained from natural sources and the collections of Moscow State University of Food Production and State Research Institute of Genetics and Selection of Industrial Microorganisms. Qualitative assay of lipase activity was carried out using a differential nutrient medium with tributyrin and dye methyl red; quantitative analysis was carried out in accordance with the modified Y. Ota & K. Yamada method at pH 5.5. Of the 23 strains with lipolytic activity (LA), 12 had sufficiently high LA indices from 2.5 to 7.5 U/cm3, of which M10 isolate with maximum activity was selected. For this isolate, morphological, cultural, physiological and biochemical properties were studied and molecular genetic identification was performed. The strain was identified as Candida parapsilosis (99 % of homology) using phylogenetic analysis and deposited in the All-Russian Collection of Industrial Microorganisms under the number Y-4055. After UV mutagenesis, a highly active mutant C. parapsilosis M10-10 was obtained. Using mathematical planning methods, the optimal nutrient medium for its growth and lipase production was determined as, %: mustard oil — 2.6, yeast extract — 1.8, soy flour — 1, glucose — 0.5, Tween 80 — 0.42, CaCO3 — 0.3, KH2PO4 — 0.03, MgSO4·7H2O — 0.02. An enzyme with a purification grade of 20× and lipolytic activity of 30630 U/g was obtained after culturing the strain M10-10 at a 30-40 °С temperature and pH of the nutrient medium 5.5-6.5. It was found that by 48 hours of fermentation, lipase reaches the highest activity in the culture medium when inoculum M10-10 is in an amount of 5%. Optimal conditions for the enzyme were determined as 37 °С and pH 5.5. In terms of activity, the resulting product is not inferior to commercial domestic and foreign enzymes, including Novozym 435 (Sigma-Aldrich, USA) with a lipolytic activity of 24020 U/g. The fatty acid specificity of the new lipase was determined by enzymatic treatment of various vegetable oils and gas chromatography of lipid products using a Shimadzu GC 2010 (Shimadzu, Japan). Modification of vegetable oils with M10-10 lipase in an oil/water emulsion significantly reduced 2.4, 4.6, 2.9 and 1.5 times the saturated fatty acids fraction (including palmitic and stearic acids) and increased 1.5, 1.6, 1.1 and 12 times the polyunsaturated fatty acids fraction (including w-3 linolenic and w-6 linoleic acids) for olive, mustard, sunflower and coconut oils, respectively.

Keywords: Candida parapsilosis M10-10, lipase producer, enzyme preparation, UV mutagenesis, fermentation conditions, lipolytic activity, vegetable oils, modification, saturated fatty acids, unsaturated fatty acids.

 

ФГБОУ ВО Московский государственный университет
пищевых производств,

125080 Россия, г. Москва, Волоколамское ш., 11,
e-mail: biotech@mgupp.ru, ludmila-churmasova@yandex.ru, natali-mng@yandex.ru ✉, daria.klabukova@yandex.ru

Поступила в редакцию
6 сентября 2019 года

 

назад в начало

 


СОДЕРЖАНИЕ

 

 

Полный текст PDF

Полный текст HTML