doi: 10.15389/agrobiology.2018.6.1247rus
УДК 637.03:573.6.086.83.001.26
Исследования выполнены при финансовой поддержке гранта РНФ
(проект № 16-16-10073).
ОБРАЗОВАНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ПЕПТИДОВ
В МЯСНОМ СЫРЬЕ ПОД ВЛИЯНИЕМ ПРОТЕАЗ РАЗЛИЧНОГО
ПРОИСХОЖДЕНИЯ
И.М. ЧЕРНУХА1, Н.Г. МАШЕНЦЕВА1, Н.Л. ВОСТРИКОВА1,
Л.И. КОВАЛЕВ2,
М.А. КОВАЛЕВА2, Д.А. АФАНАСЬЕВ3, А.А. БАЖАЕВ3
В настоящее время с целью технологической коррекции мясного сырья и повышения функциональности мясных продуктов применяется множество методов, среди которых значительный интерес вызывает ферментолиз. Для этого используются протеазы микробного, растительного или животного происхождения. При ферментативной обработке мясных продуктов саркоплазматические и миофибриллярные белки подвергаются протеолизу, в результате чего образуются пептиды, в том числе обладающие высокой физиологической активностью и выраженным лечебно-профилактическим действием. Обычно это низкомолекулярные соединения, состоящие из нескольких аминокислотных остатков. Важная особенность таких пептидов в том, что в отличие от лекарственных средств они способны быстро проникать через мембраны желудочно-кишечного тракта и далее в кровеносную систему и остальные системы организма. Мы изучили образование биопептидов в различном мясном сырье под воздействием ферментов животного (пепсин, трипсин) и растительного (папаин, бромелайн) происхождения. Образцы скелетной мышцы крупного рогатого скота Bostaurus и свиньи Sus scrofa инъецировали растворами протеаз в количестве 5 мл на 50 г мясного сырья. Ферментируемые образцы выдерживали в течение 40 мин при 30 °С для препаратов трипсина и пепсина, 30 мин при 30 °С — для папаина и бромелайна. Оптимальное значение pH для ферментов в образцах не устанавливали, ферментацию осуществляли при нативном pH мясного сырья. Влажность воздуха в помещении составляла 50-55 %. Контролем служили соответствующие образцы мышцы без ферментативной обработки. По результатам проведенного одномерного денатурирующего электрофореза в полиакриламидном геле с использованием додецилсульфата натрия (SDS-PAGE) выявлены явные количественные различия в белковых профилях исследуемого сырья, при этом для протеаз разного происхождения получили неодинаковые профили. Последующий двумерный электрофореза с изоэлектрофокусированием в амфолиновом градиенте pH (IEF-PAGE) подтвердил полученные результаты и выявил особенности используемых протеаз. Так, животные протеазы, обладая высокой специфичностью, воздействуют лишь на определенную часть мышечных белков, но практически полностью деструктурируют их до небольших пептидов (в том числе низкомолекулярных) и свободных аминокислот. Следует также отметить большую протеолитическую эффективность трипсина по сравнению с пепсином. Протеазы растительного происхождения с достаточно низкой специфичностью воздействуют на большинство мышечных белков и деструктурируют их до множества фрагментов, о чем свидетельствует появление многочисленных новых белковых фракций на 2D электрофореграмме. С помощью масс-спектрометрии были обнаружены и идентифицированы некоторые короткие пептиды в образцах с животными протеазами. После обработки растительными протеазами обнаружить короткие пептиды практически не удалось из-за недостаточной пригодности масс-спектрометрии для определения образовавшихся очень низкомолекулярных пептидов. Таким образом, растительные протеазы более активно и эффективно образуют промежуточные фракции ряда мышечных белков и биопептидов. Обработку сырья протеолитическими ферментами, на наш взгляд, можно считать наиболее эффективным способом получения биологически активных пептидов.
Ключевые слова: протеолитические ферменты, ферментолиз, биологически активные пептиды, одномерный электрофорез, SDS-PAGE, двумерный электрофорез, IEF-PAGE, MALDI-TOF, масс-спектрометрическая идентификация.
GENERATION OF BIOACTIVE PEPTIDES IN MEAT RAW MATERIALS
EXPOSED TO PROTEASES OF DIFFERENT ORIGIN
I.M. Chernukha1, N.G. Mashentseva1, N.L. Vostrikova1, L.I. Kovalev2, M.A. Kovaleva2, D.A. Afanasev3, A.A. Bazhaev3
There are plenty of methods nowadays used for the technological correction of meat raw materials and increasing the functionality of meat products. Among them, the enzymatic hydrolyses using proteases of microbial, plant or animal origin causes considerable interest. Sarcoplasmic and myofibrillar proteins of meat products are subjected to proteolysis during enzymatic treatment, resulting in the peptides generation, including those with high physiological activity and a pronounced therapeutic and preventive effect. Usually they are low molecular weight compounds consisting of several amino acid residues. It should be noted that, unlike drugs, such peptides are able to rapidly penetrate the gastrointestinal tract membranes and further into the bloodstream and the rest of the organism. The aim of this work was to study the bioactive peptides generation in various meat raw materials due to enzymatic hydrolyses by enzymes of animal (pepsin, trypsin) and plant (papain, bromelain) origin. Bos taurus and Sus scrofa skeletal muscle samples were injected with 5 ml of proteases in 50 g of raw meat. The samples were kept for 40 min at 30 °С for exposure to trypsin and pepsin solutions, 30 min at 30 °С for papain and bromelain. The optimum pH value was not established for the enzymes in the samples, the fermentation process was carried out at the native pH of the raw meat. Humidity in the room was 50-55 %. As a control, the corresponding muscle samples without enzymatic treatment were used. According to the results of a one-dimensional gel electrophoresis under denaturing conditions using sodium dodecyl sulfate (SDS-PAGE), obvious quantitative differences were found in the protein profiles of the studied raw materials, and different profiles were obtained for proteases of different origin. A subsequent two-dimensional isoelectric focusing electrophoresis in an ampholine pH gradient (IEF-PAGE) confirmed the obtained results and revealed the used proteases features. Thus, animal proteases, possessing high specificity, affect only a certain part of muscle proteins, but almost entirely destruct them to small peptides (including low molecular weight) and free amino acids. In addition, a greater proteolytic activity of trypsin compared to pepsin was noted. Plant origin proteases affect the majority of muscle proteins with a sufficiently low specificity and destruct them to many fragments, as evidenced by the presence of numerous new protein fractions on 2D-electrophoregram. Using mass spectrometry (MALDI-TOF MS and MS/MS) some short peptides were detected and identified in samples treated with animal proteases. It was practically not possible to detect short peptides after plant proteases treatment due to the insufficient suitability of mass spectrometry to determine the very low molecular weight of generated peptides. Thus, plant origin proteases generate intermediate fractions of some muscle proteins and bioactive peptides more actively and efficiently. The raw materials processing by proteolytic enzymes, in our opinion, can be regarded as the most effective way to obtain biologically active peptides.
Keywords: proteolytic enzymes, enzymatic hydrolyses, biologically active peptides, one-dimensional gel electrophoresis, SDS-PAGE, two-dimensional electrophoresis, IEF-PAGE, MALDI-TOF, mass spectrometry identification.
1ФГБНУ ФНЦ пищевых систем |
Поступила в редакцию |
