doi: 10.15389/agrobiology.2017.6.1194rus

УДК 636.52/.58:636.082:57.085.23

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РНФ № 16-16-10059.

 

ЭФФЕКТИВНОСТЬ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ БУСУЛЬФАНА
ДЛЯ ЭЛИМИНАЦИИ ПРИМОРДИАЛЬНЫХ ЗАРОДЫШЕВЫХ
КЛЕТОК В ГОНАДАХ У ЭМБРИОНОВ КУР

А.Н. ВЕТОХ, Н.А. ВОЛКОВА, Е.К. ТОМГОРОВА, Л.А. ВОЛКОВА,
Н.А. ЗИНОВЬЕВА

Использование примордиальных зародышевых клеток для получения генетически модифицированной и химерной сельскохозяйственной птицы — одно из перспективных направлений биотехнологии, которое рассматривается как альтернатива традиционным методам селекции и модификации генома. Получение трансгенных и химерных особей с использованием этой технологии предусматривает введение донорских примордиальных зародышевых клеток в дорсальную аорту эмбрионов-реципиентов в период миграции из крови в гонады. В случае колонизации донорскими зародышевыми клетками гонад эмбрионов-реципиентов возможна их дальнейшая дифференцировка до зрелых мужских и женских половых клеток. Один из основных факторов, определяющих эффективность проводимых манипуляций, — результативность элиминации собственных примордиальных зародышевых клеток у эмбрионов-реципиентов. В этой связи остается актуальной разработка приемов по удалению такого типа клеток. Целью наших исследований стала оптимизация методических подходов по элиминации примордиальных зародышевых клеток в гонадах у эмбрионов кур породы Первомайская. В качестве алкилирующего агента использовали бусульфан в дозах 10, 40, 70, 100, 150, 200 и 250 мкг/эмбрион. Для разведения бусульфана применяли диметилсульфоксид (ДМСО), а также его сочетание со средой DМЕМ в различных соотношениях. Введение бусульфана в эмбрионы осуществляли двумя способами: через прокол в скорлупе в тупом конце яйца до закладки яиц на инкубацию и посредством нанесения раствора препарата на зародышевый диск через окно в скорлупе в тупом конце яйца на 24-й ч инкубации. Эффективность элиминации примордиальных зародышевых клеток в гонадах оценивали на 7-е сут инкубации на основании гистологических исследований с использованием иммуногистохимич на экспрессию гена SSEA-1 (stage-specific embryonic antigen-1). Установлено, что результативность элиминации примордиальных зародышевых клеток определяется способом подготовки и введения бусульфана в эмбрионы, а также дозой препарата. Показано снижение негативного действия на развитие эмбрионов кур ДМСО, используемого для разведения бусульфана, при включении в состав раствора препарата среды DМЕМ в концентрации 10 %. Высокая эффективность элиминации примордиальных зародышевых клеток установлена при использовании бусульфана в концентрации 100 мкг/эмбрион: снижение числа зародышевых клеток в гонадах достигало 92 % по сравнению с контролем. Использование бусульфана в большей концентрации приводило к повышению эмбриональной смертности. При этом более высокую результативность элиминации примордиальных зародышевых клеток отмечали при введении бусульфана на 24-й час инкубации эмбрионов: количество зародышевых клеток в гонадах у 7-суточных эмбрионов кур было на 12,5 % меньше по сравнению с аналогичным показателем, установленным при инъекции препарата перед началом инкубации.

Ключевые слова: примордиальные зародышевые клетки, куры, эмбрионы, бусульфан.

 

Полный текст

 

 

EFFICIENCY OF BUSULFAN USE FOR ELIMINATING PRIMORDIAL
GERM CELLS IN THE GONADS OF CHICKEN EMBRYOS

A.N. Vetokh, N.A. Volkova, E.K. Tomgorova, L.A. Volkova, N.A. Zinovieva

The use of primordial germ cells to produce genetically modified and chimeric poultry is one of the promising areas of biotechnology. It is also considered as an alternative to traditional methods of selection and genome modification. The production of transgenic and chimeric animals using this technology provides the introduction of donor primordial germ cells into the dorsal aorta of recipient embryos during the migration of this cell type from the blood to the gonads. In the case of the colonization by donor germ cells of the recipient embryos gonads, further differentiation of donor cells to mature germ cells (both male and female) is possible. One of the main factors that determine the effectiveness of conducted manipulations is eliminating own primordial germ cells in a recipient embryos. In this regard, it remains urgent to develop effective methodical techniques for removing this type of cells. The aim of our study was to optimize methodological approaches for eliminating primordial germ cells in the gonads of chicken embryos. Busulfan was used as an alkylating agent in concentrations from 10 to 250 μg/embryo. Dimethyl sulfoxide (DMSO) was used to dilute busulfan, as well as its combination with DMEM medium in various ratios. The busulfan solution was injected into the chicken embryos prior to incubation or after 24 hour incubation. The efficiency of elimination of primordial germ cells in embryonic gonads was assessed on day 7 of incubation based on histological studies using immunohistochemistry on the expression of the SSEA-1 gene (stage-specific embryonic antigen-1). It has been established that the method of preparation and introduction of busulfan into embryos, as well as the dose of this drug determine the effectiveness of elimination primordial germ cells. Reduction of the negative effect on the development of chicken embryos when using DMSO for the dilution of busulfan was shown when the DMEM medium was included in the solution formulation at a concentration of 10 %. The high efficiency of eliminating primordial germ cells was observed when busulfan was used at a concentration of 100 μg per embryo. In this case, the number of germ cells in the gonads declined by 92 % compared to the control. The use of busulfan at a higher concentration while maintaining the effectiveness of this drug was characterized by an increase in embryonic mortality. At the same time, higher effectiveness of eliminating primordial germ cells was achieved with the introduction of busulfan after 24-hour incubation of embryos: the number of germ cells in the gonads of 7-day-old chicken embryos was 12.5 % less than in the case of injection of this drug before incubation.

Keywords: primordial germ cells, chicken, embryos, busulfan.

 

ФГБНУ Федеральный научный центр животноводства
ВИЖ им. академика Л.К. Эрнста,
142132 Россия, Московская обл., г.о. Подольск, пос. Дубровицы, 60,
e-mail: anastezuya@mail.ru

Поступила в редакцию
29 сентября 2017 года

 

назад в начало