doi: 10.15389/agrobiology.2017.6.1265rus

УДК 619:578:57.083.224

 

ПЕРМИССИВНОСТЬ КУЛЬТУР КЛЕТОК РАЗЛИЧНОГО
ПРОИСХОЖДЕНИЯ ПРИ КУЛЬТИВИРОВАНИИ ВИРУСА
НОДУЛЯРНОГО ДЕРМАТИТА

В.И. БАЛЫШЕВА, С.П. ЖИВОДЕРОВ, Е.Ю. ПИВОВА, Н.К. БОБРОВСКАЯ,
А.В. ЖИВОДЕРОВА, Л.И. АНИСИМОВА, С.Д. КУШНИР, Т.Р. УСАДОВ,
С.Г. ЮРКОВ, Н.И. САЛЬНИКОВ, А.В. ЛУНИЦИН

Нодулярный дерматит крупного рогатого скота (НД, заразный узелковый дерматит, кожная бугорчатка, узелковая экзантема, dermatitis nodulares, lumpy skin disease) — трансмиссивная вирусная высококонтагиозная трансграничная эмерджентная болезнь. В 2015 году она была занесена в Республику Дагестан из Азербайджана. В 2016 году заболевание обнаружили в Краснодарском крае, затем еще в 6 областях Российской Федерации. Болезнь приводит к снижению молочной продуктивности до 50 %, потере живой массы тела, абортам и мертворождения, повреждению шкуры, нарушению воспроизводительной функции у больных особей (вплоть до полной потери фертильности у быков) и гибели животных от секундарных инфекций. Нодулярный дерматит вызывает ДНК-содержащий вирус рода Capripoxvirus (подсемейство Chordopoxvirinae, семейства Poxviridae). Выделение и идентификация вируса, изготовление вакцинных и диагностических препаратов во многом зависят от удачного выбора системы культивирования. Целью нашей работы было изучение культуральных свойств изолята вируса нодулярного дерматита и оптимизация условий получения вирусосодержащего материала в наиболее перспективных клеточных культурах. Вирус выделяли из проб органов (печень, легкие, селезенка, лимфатические узлы и пораженная подкожная клетчатка) от вынужденно убитых быков калмыцкой породы (хозяйства Волгоградской области, 2016 год) с характерными проявлениями клинических признаков НД. Для выделения вируса готовили 10 % суспензию образцов и вносили в культуральные флаконы (по 3 флакона для каждой культуры) со сформировавшимся монослоем клеток тестикул козленка (ТК), перевиваемыми линиями клеток почек теленка (MDBK) и кролика (RК-13/2-03). В третьем пассаже титр вируса, полученного в клетках MDBK и RК-13/2-03, составлял 4,67-5,00 lg ТЦД50/см3. В вирусосодержащем культуральном материале выявляли геном вируса НД методом ПЦР. Полученный штамм вируса НД был депонирован в Государственную коллекцию микроорганизмов Всероссийского НИИ ветеринарной вирусологии и микробиологии под номером 3161. В работе с этим штаммом вируса НД также определяли пермиссивность культур клеток кожи эмбриона лося (КЭЛ/07), почки африканской зеленной мартышки (CV-1, VERO), гибридной линии клеток почки эмбриона свиньи (СПЭВ ТК-) x спленоцитов селезенки свиньи (А4С2/9к), почек овцы (ПО), кролика (RК-13/2-03) и теленка (Taurus-1). Установлено, что к вирусу чувствительны перевиваемые клеточные линии гомологичного (MDBK, Taurus-1, КЭЛ/07, ПО) и гетерологичного происхождения (RК-13/2-03, VERO, CV-1, А4С2/9к, СПЭВ). Впервые выявлено, что вирус НД размножается в клетках диких животных (лося), а также установлена возможность его культивирования в перевиваемых гетерологичных клеточных культурах RК-13/2-03 и А4С2/9к. Длительность культивирования вируса до проявления 95-100 % ЦПД зависела от клеточного субстрата и множественности заражения. В культурах клеток МDBK и VERO она составляла 48 ч, в Taurus-1, ПО, RК-13/2-03, CV-1 максимальные деструктивные изменения клеточного монослоя наблюдали через 48-96 ч после инфицирования. При оптимальной множественности заражения, составляющей 0,001-0,00001 ТЦД50/кл и культивировании в поддерживающей среде, содержащей 2-5 % сыворотки крупного рогатого скота, титр вируса, полученного в культурах клеток ПО и VERO, составлял 6,0-6,8 lg ТЦД50/см3, в клетках RК-13/2-03 – 5,8-6,6 lg ТЦД50/см3. Таким образом, наиболее перспективным представляется использование для накопления вируса НД клональной перевиваемой линии клеток почки кролика RК-13/2-03.

Ключевые слова: вирус нодулярного дерматита, перевиваемые культуры клеток, культура клеток кожи эмбриона лося, CV-1, VERO, MDBK, Taurus-1, цитопатическое действие.

 

Полный текст

 

 

PERMISSIVITY OF VARIOUS CELL CULTURES TO LUMPY SKIN DISEASE VIRUS

V.I. Balysheva, S.P. Zhivodeorov, E.Yu. Pivova, N.K. Bobrovskaya,
A.V. Zhivodeorova, L.I. Anisimova, S.D. Kushnir, T.R. Usadov,
S.G. Yurkov, N.I. Salnikov, A.V. Lunitsin

Lumpy skin disease (LSD) is a transmissible and highly contagious transboundary emergent bovine viral disease that has become especially important for the Russian Federation since 2015 when it entered the Republic of Dagestan from Azerbaijan. In 2016, the infection was found in the Krasnodar Territory and later on in six more regions of the Russian Federation. The infection causes up to 50 % drops in milk productivity, body weight loss, abortions or stillbirths, skin damage, and reproductive disorders in affected livestock up to including a complete loss of bovine fertility and animal deaths due to secondary infections. LSD is caused by a DNA virus of family Poxviridae, genus Capripoxvirus. The virus isolation, identification and vaccine or diagnostic preparation construction largely depends on the adequate culture system used. This research was aimed at characterization of the cultural properties of an LSD virus isolate detected in internal organ (lung, spleen and lymph nodes) or affected subcutaneous tissue samples from Volgograd region of Russia. In order to isolate the virus, a goatling testicle primary culture (GT), a calf kidney (MDBK) and a rabbit kidney (RK-13/2-03) continuous cell lines were used. In passage 3, the virus titer obtained in cells MDBK and RK-13/2-03 was 4.67 to 5.00 lg TCID50/cm3. Using PCR analysis, a LSD virus genome was detected in the virus-containing culture medium. The obtained LSD virus strain was deposited to the State Collection of Microorganisms of the Federal Research Center for Virology and Microbiology, # 3161. Also, the permissivity of some other cell lines including elk embryo skin (KEL/07), African green monkey kidney (CV-1) and VERO cells, a hybrid line of porcine embryo kidney cells (SPEV TK-) x porcine spleen splenocytes (А4С2/9k), and sheep kidney (ShK), rabbit kidney (RK-13/2-03) and calf kidney (Taurus-1) cells to this LSD virus strain were determined. We found that some continuous cell lines of both homologous (MDBK, Taurus-1, KEL/07, ShK) and heterologous (RK-13/2-03, VERO, CV-1, А4С2/9k, SPEV) origin were sensitive to the LSD virus. This work has revealed for the first time ever that LSD virus can proliferate in cells of wildlife species like elk. Also, permissivity of some heterologous continuous cells, RK-13/2-03 and А4С2/9k, to LSD virus was revealed for the first time. The virus culture period until 95 to 100 % CPE depended on the cell substrate selected and the multiplicity of infection. Thus, for MDBK or VERO cells it was 48 hours, and for Taurus-1, SkK, RK-13/2-03 or CV-1 the maximal destructive alterations in the cell monolayers were observed within 48 to 96 hours post infection. With an optimal multiplicity of infection of 0.001-0.00001 TCID50 per cell and 2-5 % cattle serum in the maintenance medium the LSDV titers were 6.0 to 6.8 lg TCID50/cm3 in the ShK and VERO cells, and 5.8 to 6.6 lg TCID50/cm3  for RK-13/2-03.

Keywords: lumpy skin disease virus, continuous cell lines, embryonic elk skin cell culture, CV-1, VERO, MDBK, Taurus-1, cytopathic effects.

 

ФГБНУ Федеральный исследовательский центр вирусологии и микробиологии,
601125 Россия, Владимирская обл., Петушинский р-н, пос. Вольгинский, ул. Академика Бакулова, стр. 1,
e-mail: balyvi@yandex.ru, nikolai.salnikov2010@yandex.ru,
usadov.tr@mail.ru, zhivoderov-serg@mail.ru, lunicyn@mail.ru

Поступила в редакцию
29 июля 2017 года

 

назад в начало