УДК [636.4+636.5]:631.523:577.212:57.088

ИЗУЧЕНИЕ ФАКТОРОВ, ВЛИЯЮЩИХ НА ЭФФЕКТИВНОСТЬ ПЕРЕНОСА ГЕНОВ В ПОЛОВЫЕ КЛЕТКИ САМЦОВ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ

Н.А. ВОЛКОВА1, Н.А. ЗИНОВЬЕВА1, Л.А. ВОЛКОВА1, Н.С. ЛОЦМАНОВА1, Л.К. ЭРНСТ2

Выявлены факторы и экспериментально обоснованы условия, влияющие на результативность адресной доставки ДНК в сперматогонии петухов и хряков in vivo. Высокая эффективность трансгенеза установлена при использовании генной конструкции pX-Ins в виде суспензии клеток-упаковщиц в дозе 1 млн клеток на семенник для петухов и 5 млн клеток — для хряков.

Ключевые слова: клеточная инженерия, трансгенез, ретровирусные векторы, свиньи, куры.

 

Разработка приемов генетической модификации, основанных на использовании половых клеток в качестве векторов для направленного переноса генов, рассматривается как альтернатива традиционному методу получения трансгенных животных — микроинъекции ДНК в пронуклеус зигот (1-4). Интерес к указанному направлению связан прежде всего с природной способностью клеток сперматогенного эпителия самцов поглощать чужеродную ДНК (чДНК) и переносить ее в яйцеклетку при оплодотворении. Такая интегрированная в геном чДНК может устойчиво передаваться в ряду поколений, а затраты средств и времени на получение трансгенных животных значительно сокращаются, поскольку манипуляции проводятся на взрослых особях.

Несмотря на то, что для трансформации половых клеток используют различные методы (липофекция, электропорация и вирусная трансдукция) (5-7), все еще не разработаны системы, позволяющие эффективно доставлять рекомбинантную ДНК в клетки сперматогониев.

В этой связи нами были изучены факторы, влияющие на эффективность генетической трансформации сперматогониев с помощью ретровирусных векторов.

Методика. Для трансформации клеток-мишеней использовали ретровирусный вектор pX, содержащий кДНК гормона роста (генная конструкция pX-RSVhgh) и кДНК инсулина (генная конструкция pX-Ins) человека. При упаковке ретровирусных векторов применяли линию клеток-упа-ковщиц GP + envAm12. Генные конструкции были предоставлены к.б.н. И.К. Фоминым (Институт генетики и цитологии НАН Беларуси, г. Минск).

В качестве источника генных конструкций использовали клетки-упаковщицы, продуцирующие рекомбинантный ретровирус (вектор pX), и вирусный препарат, полученный сбором ростовой среды (на основе DМЕМ), в которой культивировали клетки-упаковщицы.

Первоначально трансформацию клеток сперматогенного эпителия хряков и петухов генными конструкциями pX-RSVhGH и pX-Ins осуществляли в культуре in vitro с целью сравнения эффективности их использования для генетической модификации выбранных клеток-мишеней. Частоту генетической трансформации определяли как процентное отношение числа полученных генетически трансформированных клонов к общему числу инфицированных клеток.

Следующим этапом работы было введение генных конструкций в паренхиму семенников подопытных животных in vivo с помощью множественных инъекций (5-8 на семенник). Было проведено два опыта. В первом опыте (две группы хряков и две группы петухов по 3 особи в каждой) для трансформации клеток-мишеней использовали обе конструкции (pX-RSVhGH и pX-Ins), которые вводили в виде вирусного препарата с целью сравнения эффективности трансформации клеток сперматогенного эпителия этими конструкциями. На основании полученных результатов выявляли более эффективную конструкцию, которую использовали в дальнейшем. Во втором опыте (три группы хряков и три группы петухов по 3 особи в каждой) определяли количество вводимой генной конструкции, позволяющее повысить эффективность трансгенеза. В качестве источника генной конструкции использовали суспензию клеток-упаковщиц (в различных дозах) в среде DMEM, предварительно заблокировав митоз митомицином С.

С целью выявления экспрессии генной конструкции готовили гистологические препараты семенников, полученных при кастрации или убое животных (8). Иммуногистохимическое окрашивание срезов проводили с использованием специфических антител к выявляемому рекомбинантному белку. В качестве хромогена служил диаминобензидин (ДАБ). Для анализа использовали не менее 20 гистологических срезов толщиной 4-5 мкм с интервалом 50 мкм.

Полученные данные обрабатывали статистически (9).

Результаты. Частота генетической трансформации клеток сперматогенного эпителия хряков и петухов in vitro варьировала в зависимости от метода трансфекции и используемой генной конструкции. Наибольшую долю генетически трансформированных клонов получили при совместном культивировании с клетками-упаковщицами. В частности, при использовании генной конструкции pX-Ins регистрировали от 0,4 до 0,6 % трансформированных клеток в зависимости от вида животного. При инфицировании клеток сперматогенного эпителия вирусным препаратом эффективность трансформации клеток-мишеней оказалась в 2,2-3,1 раза ниже.

Аналогичные данные получили и при использовании генной конструкции pX-RSVhGH. В этом случае эффективность генетической трансформации первичной культуры клеток семенника была несколько ниже по сравнению с применением генной конструкции pX-Ins и составила в варианте с клетками-упаковщицами 0,2-0,5 %, а при инфицировании вирусным препаратом — 0,1-0,2 %.

Результаты исследований, полученные в опытах in vitro, послужили основой для проведения дальнейших исследований по переносу рекомбинантной ДНК в клетки сперматогенного эпителия хряков и петухов in vivo.

Сравнение эффективности использования генных конструкций pX-RSVhGH и pX-Ins при введении в семенники хряков и петухов показало, что в первом варианте (конструкцияp X-RSVhGH, содержащая кДНК гормона роста человека) интеграция и экспрессия трансгена в клетках сперматогенного эпителия подопытных животных наблюдалась только у петухов: положительные сигналы обнаруживались на 10 из 60 проанализированных срезов (табл. 1).

Число трансформированных канальцев на одном срезе варьировало от 0,22±0,04 до 0,42±0,11 и составило в среднем по группе 0,05±0,09 при эффективности трансформации (процентное отношение числа трансформированных сперматогониев к их общему числу во всех исследованных семенных канальцах) 0,06 %. В то же время в одном семенном канальце максимальное число трансформированных клеток не превышало 3.

1. Эффективность трансформации семенных канальцев и сперматогониев подопытных животных при использовании генных конструкций pX-RSVhGH и pX-Ins

Показатель

Хряки

Петухи

I группа

II группа

I группа

II группа

О б щ и е  п о к а з а т е л и

Число животных, n

3

3

3

3

Число срезов, n

60

60

60

60

Число исследованных семенных канальцев, n

601

600

409

401

С е м е н н ы е  к а н а л ь ц ы

Число и доля срезов с трансформированными
семенными канальцами, n (%)

0 (0)

9 (15)

10 (17)

12 (20)

Доля трансформированных канальцев, %:

 

 

 

 

минимальная на одном срезе
максимальная на одном срезе
в среднем по группе

0
0
0

0,20±0,07
0,51±0,08
0,06±0,03

0,22±0,04
0,42±0,11
0,05±0,09

0,19±0,03
0,59±0,07
0,07±0,04

 С п е р м а т о г о н и и

Число трансформированных сперматогониев, n

0

18

16

22

Среднее число клеток в семенном канальце, n

38

39

68

71

Общее число исследованных клеток, n

22838

23400

27812

28471

Эффективность трансформации, %

0

0,08

0,06

0,08

П р и м е ч а н и е. В I группе для инъекций использовали генную конструкцию pX-RSVhGH, во II — генную конструкцию pX-Ins. Источником генных конструкций служил вирусный препарат (доза — 1×105 КОЕ).

У хряков при введении генной конструкции pX-RSVhGH наличия трансформированных канальцев и сперматогониев не выявили.

Введение генной конструкции pX-Insв семенники петухов и хряков было более эффективным: интеграция и экспрессия генной конструкции в клетках сперматогенного эпителия была установлена у всех подопытных животных. Иммуногистохимический анализ показал наличие трансформированных клеток на 9-12 из 60 проанализированных срезов семенников; число трансформированных клеток в одном семенном канальце варьировало от 1 до 2, общее на одном срезе — доходило до 4. Эффективность трансформации сперматогониев достигала 0,08 %.

2. Эффективность трансформации клеток сперматогенного эпителия подопытных животных в зависимости от количества введенной генной конструкции pX-Ins  

Показатель

Хряки

Петухи

I группа

II группа

III группа

I группа

II группа

III группа

Доза клеток-упаковщиц, млн на семенник

3

5

7

0,5

1

2

Число трансформированных
сперматогониева, n 

99

123

120

134

176

127

Среднее число клеток в семенных
канальцаха, n

41

39

41

70

68

71

Число семенных канальцева, n

594

645

705

399

407

401

Общее число клетока, n

24354

25155

28905

27930

26767

28471

Эффективность трансформацииб, %

0,40

0,49

0,42

0,48

0,66

0,45

П р и м е ч а н и е. а — суммарные данные по группе (по 60 гистологическим срезам); б — процентное отношение числа трансформированных сперматогониев к общему числу исследованных.

Использование в качестве источника генной конструкции pX-Ins суспензии клеток-упаковщиц позволило повысить эффективность трансгенеза. С увеличением дозы вводимых клеток-упаковщиц наблюдалось повышение эффективности трансформации сперматогониев (табл. 2). В частности, у хряков при введении генной конструкции в дозе 3 млн кл/семенник показатель составил 0,40 %, в то время как при инъецировании 5 млн кл/семенник он равнялся 0,49 %. У петухов аналогичный показатель составил при введении клеток-упаковщиц в дозе 0,5 млн и 1 млн кл/семенник соответственно 0,48 и 0,66 %.

Вместе с тем следует отметить некоторое снижение эффективности трансформации клеток сперматогенного эпителия при увеличении инъецируемой дозы генных конструкций в расчете на семенник (с 5 млн до 7 млн клеток у хряков и с 1 млн до 2 млн клеток у петухов), что, возможно, связано с иммунной реакцией на присутствие чужеродного клеточного материала, тогда как введение генных конструкций в меньшем количестве (до 5 млн клеток у хряков и 1 млн клеток у петухов) вызывало не столь выраженную ответную реакцию организма. Иными словами, клетки-упаковщицы в дозе (на семенник) около 5 млн для хряков и 1 млн для петухов следует считать оптимальным источником генных конструкций с точки зрения эффективности трансформации клеток сперматогенного эпителия.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о возможности применения ретровирусных векторов для генетической трансформации половых клеток хряков, петухов и перспективности использования этой системы переноса генов для получения трансгенных животных с заданными свойствами.

Л И Т Е Р А Т У Р А

1. B r i n s t e r  R.L.,  N a g a n o  M. Spermatogonial stem cell transplantation, cryopreservation and culture. Semin. Cell. Dev. Biol., 1998, 9(4): 401-409.
2. С а в ч е н к о в а  И.П.,  К о р ж и к о в а  С.В.,  К о с т е р е в а  Н.В.,  Э р н с т  Л.К. Культивирование и трансплантация сперматогониев типа А хряков. Онтогенез, 2006, 37(4): 292-300.
3. Н о в г о р о д о в а  И.П.,  М о р м ы ш е в  А.Н.,  В о л к о в а  Н.А.,  З и н о в ь е в а  Н.А.,  Э р н с т  Л.К. Генетическая трансформация сперматогониев кроликов in vivo.  Биотехнология, 2008, 1: 24-28.
4. Э р н с т  Л.К.,  В о л к о в а  Н.А.,  З и н о в ь е в а  Н.А. Некоторые аспекты использования трансгенных технологий в животноводстве. С.-х. биол., 2009, 2: 4-9.
5. К у з н е ц о в  А.В.,  П и р к о в а  А.В.,  Д в о р я н ч и к о в  Г.А. Исследования переноса чужеродных генов сперматозоидами в яйцеклетки мидии Mytilusgalloprovincialis Lam. Онтогенез, 2001, 32(4): 309-318.
6. T s a i  H.J.,  L a i  C.H.,  Y a n g  H.S. Sperm as a carrier to introduce an exogenous DNA fragment into the oocyte of Japanese abalone (Haliotis divorsicolor suportexta). Transgenic Res., 1997,  6(1): 85-95.
7. B a c h i l l e r  D.,  S c h e l l a n d e r  K.,  P e l i  J. Liposome-mediated DNA uptake by sperm cells. Mol. Reprod. Dev., 1991, 30(3): 194-200.
8. Р о м е й с  Б. Микроскопическая техника. М., 1953.
9. М е р к у р ь е в а  Е.К.,  А б р а м о в а  З.В.,  Б а к а й  А.В.,  К о ч и ш  И.И. Генетика. М., 1991.

 

STUDY OF FACTORS AFFECTED THE EFFICIENCY OF GENE TRANSFER INTO THE MALE GERM CELLS OF AGRICULTURAL ANIMALS

N.A. Volkova1, N.A. Zinovieva1, L.A. Volkova1, N.S. Lotsmanova1, L.K. Ernst3

The factors affected the efficiency of the address DNA transfer into the chicken and pigs spermatogonia cells in vivo were evaluated. The maximal efficiency of gene transfer was observed using suspension of packaging cells containing the retrovirus vector pX-Ins in concentration of 1 and 5 million cells per testis for chicken and pigs, respectively.

Key words: cell engineering, transgenesis, retrovirus vectors, pigs, chickens.

1ГНУ Всероссийский НИИ животноводства
Россельхозакадемии,
142132 Московская обл., Подольский р-н, пос. Дубровицы,
e-mail: natavolkova@inbox.ru;
2Российская академия сельскохозяйственных наук,
117218 г. Москва, ГСП-7, ул. Кржижановского, 15, корп. 2,
e-mail: ernstrashn@yandex.ru

Поступила в редакцию
27 сентября 2010 года

 

Оформление электронного оттиска

назад в начало