УДК 636/639:614.31:615.331

МЕТОДЫ САНИТАРНОГО КОНТРОЛЯ ЖИВОТНОВОДЧЕСКОЙ ПРОДУКЦИИ. СООБЩЕНИЕ II. ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ БАЦИТРАЦИНА

Г.П. КОНОНЕНКО, А.А. БУРКИН

На основе поликлональных кроличьих антител к конъюгату бацитрацина (БТ) с глюкозоксидазой и иммобилизованного конъюгата БТ с желатином разработана тест-система для непрямого конкурентного иммуноферментного анализа (ИФА) с чувствительностью определения 1,0 нг/мл. Обсуждается возможность применения ИФА для определения остаточных количеств БТ в продукции животноводства (молоко, мясо, яйцо) и контроля за нормами введения антибиотика в корма.

Ключевые слова: бацитрацин, иммуноферментный анализ, корма, молоко, мясо, яйца.

 

Бацитрацин (БТ) (полипептидный антибиотик, продуцируемый Bacillus subtilis и B. licheniformis) уже несколько десятилетий производится в больших объемах и широко применяется как в терапевтических целях, так и в качестве анаболического средства (1, 2). Для определения БТ в кормах предложено несколько методов на основе высокоэффективной жидкостной хроматографии (3-6) и иммуноанализа (7, 8), однако проблема контроля полноты его выведения из тканей животных до сих пор не решена. Развитие высокочувствительных физико-химических приемов индикации объективно ограничивается пептидной природой этого антибиотика и, как следствие, методическими трудностями, возникающими при его извлечении, отделении от сопутствующих веществ и детектировании. Иммунохимические методы, само создание которых было вызвано необходимостью анализа лабильных физиологически активных белков и ферментов, имеют несомненные преимущества и позволяют успешно проводить избирательное определение пептидов в нативных экстрактах.

 Нашей целью было получение специфических иммунореагентов и разработка метода непрямого конкурентного твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) бацитрацина (БТ) в продуктах животноводства.

Методика. Использовали бацитрацин (B 0125), глюкозоксидазу (ГО) (EC 1.1.3.4, G 2133) («Sigma», США), глутаровый альдегид («Reanal», Венгрия), органические растворители («Fluka», Германия), а также отечественные препараты — бычий сывороточный альбумин (БСА), яичный альбумин (ЯА), желатин (Жел) и антивидовой ферментный конъюгат, полученный, как описано (9), из пероксидазы хрена (КФ 1.11.1.7) и антисыворотки осла к кроличьим иммуноглобулинам. ИФА выполняли на высокосвязывающих полистирольных планшетах (№ 9018, «Costar», США), измерение оптической плотности проводили на планшетном фотометре АКИ-Ц-01 (Россия). Синтез белковых конъюгатов БТ осуществляли в реакции с глутаровым альдегидом (10). Продукты реакции диализовали против трех смен 1000-кратного объема раствора хлористого натрия (0,5 %) в течение 2 сут. Диализаты хранили при температуре -10…-15 °С, предварительно добавив равный объем глицерина. Для синтеза белковых конъюгатов использовали раствор БТ в диметилформамиде с концентрацией 10 нг/мл.

Для получения ГО-БТ(50) к раствору, который содержал 10 мг ГО (0,05 мкмоль) в 1,5 мл дистиллированной воды, добавляли 4 мг БТ (0,4 мл аликвоты исходного раствора), что соответствовало 50-кратному мольному избытку по отношению к белку. Для получения БСА-БТ(25), ЯА-БТ(25) и Жел-БТ(25) к растворам БСА (7 мг, 0,1 мкмоль), ЯА (4 мг, 0,1 мкмоль) и  Жел (8 мг, 0,05 мкмоль) в 1,5 мл воды добавляли аликвоты исходного раствора БТ (0,4; 0,4 и 0,2 мл), соответствующие 25-кратному мольному избытку по отношению к белкам. Далее во все смеси добавляли по 30 мкл свежеприготовленного водного раствора глутарового альдегида (2,5 %), помещали на магнитную мешалку на 2 ч при комнатной температуре, после чего вносили по 0,2 мл водного раствора боргидрида натрия (концентрация — 2 мг/мл), выдерживали, периодически помешивая, 1 ч при 4 °С и затем диализовали.

Кроликов-самцов серой масти (живая масса 2-3 кг) иммунизировали конъюгатом ГО-БТ(50): в 1-ю инъекцию вводили подкожно (10-15 точек в области спины) 100 мкг иммуногена в полном адъюванте Фрейнда, во 2-ю и все последующие, осуществляемые с месячным интервалом, — по 100 мкг иммуногена в физиологическом растворе. Через 7 сут после каждой повторной инъекции у животных из краевой вены уха отбирали кровь, отделяли сыворотку, добавляли равный объем глицерина и хранили образцы при -10…-15 °С. Тестирование сывороток проводили методом конкурентного ИФА при концентрациях реагентов, обеспечивающих интенсивность аналитического сигнала (оптическую плотность) 0,8-1,2 опт. ед. Для испытаний конъюгатов БТ в качестве твердофазного антигена использовали их растворы (0,05 или 0,15 мкг/мл) в карбонат-бикарбонатном буфере (0,05 М, рН 9,5). Рабочий раствор БТ для конкурентного анализа (1 мкг/мл) готовили из исходного раствора в дистиллированной воде (1 мг/мл) ступенчатым разбавлением водой или смесью ацетонитрил:вода (84:16).

Для иммобилизации конъюгата по 0,2 мл его раствора в карбонат-бикарбонатном буфере (0,05 М, рН 9,5) помещали в ячейки и инкубировали 16 ч при 4 °С. Затем ячейки отмывали 4-5 раз фосфатно-солевым буфером (рН 7,5), содержащим Твин 20, вносили в них по 0,1 мл растворов антител, рабочих растворов БТ или анализируемых проб в том же буфере и инкубировали 1 ч при комнатной температуре, после чего повторно отмывали и каждую заполняли раствором ферментного конъюгата (0,2 мл). После 1 ч инкубации опять отмывали и вносили по 0,2 мл субстратного раствора, содержащего о-фенилендиамин (0,4 мг/мл) и Н2О2 (0,005 %) в цитрат-фосфатном буфере (0,15 М, рН 5,0). Через 45 мин в ячейки помещали по 50 мкл серной кислоты (4 М), содержащей Na2SO3 (0,1 М), и проводили измерение оптической плотности при λ = 492 нм.

С помощью оптимизированного варианта тест-системы анализировали пробы молока, мяса кур и яиц из торговой сети г. Москвы и образцы кормов, полученные из животноводческих хозяйств.

 Результаты. Мы использовали коммерческий биохимический реактив БТ (B 0125, «Sigma», США). Судя по приведенной в каталоге брутто-формуле, он представляет собой бацитрацин А1 (БТА1). Этот пептид состоит из 12 аминокислотных остатков и имеет необычную структуру, которая, как считается, защищает его от разрушения протеазами: молекула содержит тиазолиновое кольцо, образованное конденсацией карбоксильной группы L-изолейцина (L-Иле1) с амино- и сульфгидрильной группами L-цистеина (L-Цис2), а также циклический гептапептидный фрагмент, состоящий из  L- и D-аминокислот (рис. 1).

Как следует из недавнего сообщения (10), при хроматографическом разделении этого реактива наряду с бацитрацином А1 получены два его


Формула.jpg

Рис. 1. Химическая структура бацитрацина А1.

структурных аналога — бацитрацины В1 и В2, у которых место соответственно L-Иле5 и L-Иле8 (см. рис. 1) занимает L-валин, однако их доля в продукте неизвестна. По мнению многих авторов, при аналитических исследованиях необходим унифицированный калибрант, в качестве которого, в частности, предлагается использовать американский фармакопейный цинк-бацитрацин (USP zinc bacitracin) (4).

Располагая только коммерческим реактивом БТ, мы аттестовали его по характеристикам УФ-поглощения (табл. 1). Значение молярной экстинкции e для длинноволнового максимума поглощения при 250 нм, полученное усреднением результатов трех измерений, составило 3320 и далее использовалось для уточнения концентраций калибровочных растворов.

1. Характеристики УФ-поглощения водных растворов бацитрацина

λ, нм

C, мкг/мл

ОП, опт. ед.

e

eср.

198

20

1,112

79 060

67 830

40

1,592

56 600

200

Не определяли

 

250

20

0,054

2950

3320

40

0,089

3160

200

0,415

3840

П р и м е ч а н и е. ОП — оптическая плотность, e — молярная экстинкция, С — концентрация, λ — длина волны.

Присутствие свободной концевой аминогруппы в молекуле БТ дела-


Рис. 2. Конкурентный иммуноферментный анализ (ИФА) бацитрацина (БТ) с использованием антисывороток к ГО-БТ(50) 1-3-го отборов крови (1-3) и твердофазного антигена БСА-БТ(25) (А), а также антисыворотки к ГО-БТ(50) от 3-го отбора крови и твердофазного антигена Жел-БТ(25) в ФСБ-т (4), в смеси ацетонитрила с водой при 10-кратном разбавлении ФСБ-т (5) и в молоке при 3-кратном разбавлении ФСБ-т (6) (Б).

ГО-БТ(50), БСА-БТ(25) и Жел-БТ(25) — конъюгаты соответственно глюкозоксидазы, бычьего сывороточного альбумина и желатина с бацитрацином (БТ), полученные соответственно при 50-кратном и 25-кратных мольных избытках БТ; ФСБ-т — фосфатно-солевой буфер (рН 7,5), содержащий Твин 20.

ет возможным его ковалентное связывание с любым белковым носителем при помощи глутарового альдегида. Действительно, в соответствии со стандартной методикой были получены конъюгаты, которые после диализа использовались при иммунизации и в качестве твердофазных антигенов.

Выбранный для иммунизации конъюгат ГО-БТ(50) уже после 2-го введения (при 1-м отборе крови) обеспечил получение антител с рабочим титром 1:25 000 и возможность определять БТ при разведении до концентрации 10 нг/мл (рис. 2, А). Продолжение иммунизации до 3-го отбора сопровождалось сохранением указанного высокого рабочего титра антител и увеличением чувствительности анализа почти на два порядка (рис. 2, А).

2. Степень связывания (%) антител к ГО-БТ(50) в сыворотке от 3-го отбора крови с различными иммобилизованными антигенами в присутствии бацитрацина

Иммобилизованный
антиген (0,05 мкг/мл)

БТ, нг/мл

100

10

1

0,1

БСА-БТ(25)

19

40

80

97

Жел-БТ(25)

13

32

74

93

ГО-БТ(50)

26

41

75

94

П р и м е ч а н и е. БТ, БСА, Жел и ГО — соответственно бацитрацин, бычий сывороточный альбумин, желатин и глюкозоксидаза.

При оценке избирательности анализа необходимо учитывать, что в ветеринарных препаратах в качестве действующего вещества чаще всего используют метилендисалицилат БТ или его комплексные соединения с солями двухвалентных металлов (например, цинк-бацитрацин), которые обладают более выраженным противобактериальным действием.

Для БТ известна способность к легкому образованию комплексов с двухвалентыми ионами Zn, Co, Ni и Cu при смешивании растворов с эквимолярными концентрациями, что сопровождается изменениями в его структуре. Изучение строения комплекса Co(II)-БТА1 в водном растворе показало, что «хвостовой» аминокислотный фрагмент молекулы (L-Иле1-D-Глу4) сближает ион Co(II) с единственным имидазольным кольцом L-Гис10, связывая первый с циклической гептапептидной частью молекулы. Поскольку комплексообразование БТ может приводить к изменениям в ориентации отдельных участков молекулы, мы проанализировали, как антитела против несвязанного БТ узнают комплекс БТ с Co(II), полученный по методике, описанной J.D. Epperson с соавт. (11), и не выявили каких-либо существенных различий. Величина равноингибирующих концентраций ИК50 (ингибирование связывания антител на 50 %) для комплекса и свободного вещества составила соответственно 5,0 и 7,0 нг/мл. По-видимому, комплексообразование существенно не изменяет пространственную конфигурацию молекулы, поэтому связанные формы БТ столь же эффективно распознаются антителами. Интересно отметить, что комплексообразование также не влияло на спектральные характеристики — для цинк-бацитрацина максимум УФ-поглощения приходился на 252 нм при величине молярной экстинкции 2675, близкой к значению для несвязанного БТ (12). Поскольку лигандами в таких комплексах выступают атом N имидазольного кольца L-Гис10, карбоксильная группа D-Глу4 и атом N тиазолинового кольца, а N-концевая аминогруппа не участвует в связывании, ранее удалось конъюгировать цинк-бацитрацин с белками для получения иммунореагентов (7).

Дальнейшую оптимизацию условий анализа проводили только с тремя твердофазными антигенами (табл. 2), поскольку ЯА-БТ(25) в этом качестве не обеспечивал связывания с антителами уже при тестировании 1-й сыворотки. Для растворов БТ с концентрациями 1-100 нг/мл линейность аналитического сигнала в интервале 10-90 % в наибольшей мере достигалась при использовании Жел-БТ(25), остальные два уступали ему, но также были иммунореактивными, то есть не только связывали антитела, но и участвовали в торможении связывания (табл. 2).

При использовании иммобилизованного Жел-БТ(25) и калибровочных растворов БТ в условиях промежуточной прецизионности ежесуточно или с интервалом 1-2 сут (n = 10) значения степени связывания антител (%) имели относительное стандартное отклонение не более 0,05, что указывало на стабильное функционирование тест-системы в лабораторных условиях при обычных колебаниях внешних факторов.

Результаты оценки применимости тест-системы для анализа молока показали (см. рис. 2, Б), что при его 3-кратном разведении ФСБ-т градуировочный график ИФА не изменялся и нижний предел определения БТ соответствовал уровню 3 мкг/кг. Для шести проб сухого молока, которые перед анализом разбавляли водой в соответствии с инструкциями на упаковках, величина аналитического сигнала составила 95-101 % к контролю. Из 19 проанализированных проб пастеризованного и стерилизованного коровьего молока антибиотик присутствовал в двух в количестве соответственно 7 и 10 мкг/кг, а по остальным результат был отрицательным. Таким образом, при санитарно-гигиеническом контроле необходимо учитывать вероятность присутствия БТ в молоке, и ИФА может использоваться как надежный способ его обнаружения.

Согласно нашим предыдущим исследованиям, использование для экстракции микотоксинов из кормов смеси ацетонитрил:вода в объемном соотношении 86:14 при соотношении массы навески (г) и объема экстрагента (мл) 1:5 с последующим 10-кратным разведением экстрактов буферным раствором не создает фоновых эффектов в ИФА. При введении в ФСБ-т 10 % такой экстрагирующей смеси аналитические характеристики тест-системы практически не изменились: степень связывания антител для растворов БТ с концентрациями 1, 10 и 100 нг/мл составила 88±4, 44±2 и 13±1 % при n = 5 (см. рис. 2, Б). Возможность использования указанного выше приема подготовки проб кормов была подтверждена при анализе случайной выборки из 80 образцов. Для муки животного происхождения (12 проб), белково-витаминно-минеральных добавок (11 проб) и большинства исследованных образцов комбикормов (52 из 57) связывание антител составляло 92-114 % относительно контроля со срединными значениями соответственно 97, 98 и 106 %. Для пяти образцов комбикормов результат оказался положительным, но обнаруженное количество БТ (0,05; 0,05; 0,20; 1,20 и 2,90 мг/кг) было на несколько порядков ниже терапевтических и анаболических доз (по-видимому, это были случаи использования БТ в малых количествах в качестве профилактической подкормки) (13). В целом следует признать, что ИФА со столь высокой чувствительностью (0,05 мг/кг) не имеет перспективы практического использования для оценки соответствия нормам введения БТ в корма, хотя разработки в этом направлении были осуществлены  (7, 8).

Для других видов продукции животноводства (мясо, яйцо) жидкостная экстракция антибиотиков органическими растворителями также может быть целесообразна при условии предварительного обезвоживания проб (лиофилизация, термовысушивание). Наши эксперименты показали, что для экстракции воздушно-сухих образцов гомогенизированной мышечной ткани и яиц смесью ацетонитрила с водой достаточно соотношения между сырой массой навески (г) и объемом экстрагента (мл) 1:1. Разбавление таких экстрактов перед анализом в 10 раз буферным раствором, как и ранее  (14), не приводило к искажению результатов. Для всех трех концентраций калибранта показатели степени связывания антител практически не отличалась от значений, полученных в водно-ацетонитрильной смеси, разбавленной ФСБ-т (см. рис. 2, Б). Для экстрактов куриного мяса (n= 5) эти значения равнялись 87±3, 49±3 и 16±2 %, для экстрактов куриных яиц — 88±2, 44±2 и 14±1 %. В этих условиях ожидаемый нижний предел измерения остатков БТ в мясе и яйцах составлял 10 мкг/кг. Согласно нормам, действующим в Российской Федерации, наличие БТ в мясе и яйцах не допускается, а чувствительность аналитического метода должна обеспечивать его надежную индикацию при содержании 20 мкг/кг (15). Используя анализ водно-солевых экстрактов мяса и яиц, можно достигать еще большей чувствительности определения БТ в пробах даже при необходимости их многократного разведения.

Итак, разработанная иммуноферментная тест-система обладает необходимой высокой чувствительностью для определения остаточных количеств бацитрацина. Оптимизация условий подготовки проб для иммуно-анализа может обеспечить практических специалистов простым и надежным способом контроля безопасности всех видов животноводческой продукции по этому показателю. 

Л И Т Е Р А Т У Р А

1. К л е н о в а  И.Ф.,  Я р е м е н к о  Н.А. Ветеринарные препараты в России: Справочник. М., 2001.
2. S w i c k  R.A. Role of growth promotants in poultry and swine feed. Technical Bulletin ASA, 1996, AN04: 1-10.
3. R a g h e b  H.S. Evaluation of methanol extraction for determination of bacitracin in feeds. J. Assoc. Anal. Chem., 1980, 63(3): 444-447.
4. R a g h e b  H.S. Bacitracin determination in feeds: evaluation of methods. J. Assoc. Anal. Chem., 1981, 64(4): 980-990.
5. G a l l a g h e r  J.B.,  L o v e  P.W.,  K n o t t s  L.L. High pressure liquid chromatographic determination of bacitracin in premix feeds and finished feeds: collaborative study. J. Assoc. Anal. Chem., 1982, 65(5): 1178-1185.
6. C a p i t a n - V a l l v e y  L.F.,  T i t o s  A.,  C h e c a  R.,  N a v a s  N. High pressure liquid chromatographic determination of  Zn-bacitracin in animal feed by post-column derivatization and fluorescence detection. J. Chromatog. A, 2002, 943(2): 227-234.
7. W i l l i a m s  C.,  P a t e l  I.,  W i l l e r  C.J.,  C r o s b y  N.T. Competitive enzyme-linked immunosorbent assay for the determination of zinc bacitracin in animal feedingstuffs. Analyst, 1994, 119(3): 427-430.
8. S i t u  C.,  E l l i o t t  C.T. Simultaneous and rapid detection of five banned antibiotic growth promoters by immunoassay. Analytica Chimica Acta, 2005, 529(1-2): 89-96.
9. N a k a n e  P.K.,  K a w a o i  A. Peroxidase-labeled antibody. A new method of conjugation.  J. Histochem. Cytochem., 1974, 22(2): 1084-1091.
10. H e r m a n s o n  G.T. Bioconjugate techniques. San Diego-New York-Boston-London-Sydney-Tokyo-Toronto, Academic Press, 1996: 470-472.
11. E p p e r s o n  J.D.,  M i n g  L.-J. Proton NMR studies of Co(II) complexes of the peptide antibiotic bacitracin and analogues: insight into structure-activity relationship. Biochemistry, 2000, 39: 4037-4045.
12. C l a r k  E.G.C. Isolation and identification of drugs. London, 1986.
13. Л е о н о в  Н.И.,  С к р я б и н  Г.К.,  С о л н ц е в  К.М. Антибиотики в животноводстве. М., 1962.
14. Б у р к и н  А.А.,  К о н о н е н к о  Г.П.,  Б у р к и н   М.А. Методы санитарного контроля животноводческой продукции. Сообщение I. Иммуноферментный анализ тетрациклинов. С.-х. биол., 2010, 4: 110-117.
15. Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов. Санитарно-эпидемиологические правила и нормативы. СанПиН 2.3.2.1078-01. М., 2002.

 

METHODS OF SANITARY SURVEILLANCE FOR LIVESTOCK PRODUCTION. II. ENZYME IMMUNOASSAY (EIA) OF BACITRACIN

G.P. Kononenko, A.A. Burkin

The authors developed the test-system for detection of bacitracin (BT) on basis of indirect competitive enzyme immunoassay (EIA) with use of rabbit polyclonal antibodies against a conjugate of this antibiotic with glucosoxydase and immobilized BT conjugate with gelatin. The sensitivity of BT assay is less than 1.0 ng/ml. The possibility of EIA use for detection of residual amount of BT in livestock production (milk, meat, eggs) and for the surveillance for antibiotic addition to food is discussed.

Key words: bacitracin, immunoassay, feeds, milk, meat, eggs.

ГНУ Всероссийский НИИ ветеринарной
санитарии, гигиены и экологии
Россельхозакадемии,

123022 г. Москва, Звенигородское ш., 5,
e-mail: vniivshe@mail.ru

Поступила в редакцию
1 июля 2010 года

 

Оформление электронного оттиска

назад в начало