Сельскохозяйственная биология, 2010, № 6, с. 20-25.

УДК 636.2:575.174:577.212

АНАЛИЗ 30 МИКРОСАТЕЛЛИТНЫХ МАРКЕРОВ У ШЕСТИ ЛОКАЛЬНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

Т.Ю. КИСЕЛЕВА¹, Б.Е. ПОДОБА², Е.Е. ЗАБЛУДОВСКИЙ², В.П. ТЕРЛЕЦКИЙ¹, Н.И. ВОРОБЬЕВ¹, Ю. KАНТАНЕН³

Проанализировали ДНК 238 животных из шести локальных популяций крупного рогатого скота (суксунской, истобенской, ярославской, серой украинской, холмогорской пород и печорского типа холмогорского скота) по микросателлитным маркерам BM1824, BM2113, BM1818, CSRM60, CSSM66, ETH3, ETH10, ETH152, ETH185, ETH225, HAUT24, HAUT27, HEL1, HEL5, HEL9, HEL13, INRA023, INRA032, INRA035, INRA037, INRA063, ILSTS005, ILSTS006, MM122, INRA005, SPS115, TGLA227, TGLA126, TGLA122, TGLA53. Дана характеристика каждого локуса по длине, числу аллелей, наблюдаемой и ожидаемой гетерозиготности, F_is -коэффициенту. Проведена генетическая оценка популяций по общему числу выявленных аллелей, наблюдаемой и ожидаемой гетерозиготности (несмещенная оценка), среднему числу аллелей на локус, числу частных и эффективных аллелей, а также F_is с учетом доверительного интервала 95 %.

Ключевые слова: микросателлитные маркеры, аллели, локальные породы, крупный рогатый скот.

Внутривидовое биологическое разнообразие пород крупного рогатого скота (КРС) представляет интерес с точки зрения популяционной генетики и сохранения генофонда, а также служит источником ценных генотипов для практической селекции. Данные о генетической структуре пород имеют значение при исследовании эволюции сельскохозяйственных животных. При этом следует отметить, что локальные (местные) популяции КРС сохраняют большую индивидуальную изменчивость по сравнению с коммерческими породами. Широкое использование искусственного осеменения КРС привело к потере ряда ценных аллелей. Опыты с аргентинским креольским скотом (локальная порода из Южной Америки) и американскими голштинами выявили более высокую степень генетической дивергенции по локусам, связанным с молочной продуктивностью у местного скота (1). Оценка североевропейских коммерческих пород показала отсутствие некоторых аллелей локуса трансферрина (2). В России при тенденции вытеснения местных пород коммерческими возможны необратимые потери ценного отечественного генофонда, сформированного в процессе многолетней адаптацией скота к локальным условиям окружающей среды.

Местные породы могут обладать присущими только им комбинациями аллелей и быть важным резервом генетической вариабельности для коммерческих пород домашних животных. Очевидно, что такие аллели должны быть обнаружены, сохранены и использованы в селекционной работе (3-5). Поэтому крайне актуально выявить генетически уникальные породы.

В настоящее время при изучении структуры популяций наиболее распространено генотипирование по аллелям микросателлитных локусов. Их местоположение имеет важное значение для поиска генов-кандидатов, отвечающих за хозяйственно полезные количественные признаки (QTLs), проявление наследственных заболеваний (что используется при разработке методов профилактики и лечения), поскольку аллели микросателлитов могут наследоваться сцепленно с аллелями таких генов. Поиск локусов, отвечающих за хозяйственно ценные признаки, проводят на основании анализа длины микросателлитных фрагментов ДНК с помощью специальных статистических программ, содержащих сведения о молочной и мясной продуктивности (6, 7). Наличие большого числа аллелей позволяет точно идентифицировать любой индивидуум, поскольку микросателлиты обнаружены практически у всех живых организмов. В настоящее время оценка происхождения по микросателлитным маркерам точнее, чем по группам крови. Поэтому в мировой практике при продаже племенных животных за рубеж требуется подтверждение их происхождения по данным анализа микросателлитной ДНК. Существуют рекомендации ФАО, какие микросателлиты использовать для генетической оценки крупного рогатого скота (8).

Согласно базе данных INRA (French National Institute for Agricultural research), к настоящему времени у КРС выявлено 2402 микросателлита, из которых 2244 картированы (микросателлиты имеются на всех 30 парах хромосом). Для популяционно-генетического анализа разработаны и совершенствуются пакеты компьютерных программ — Arlequin, GDA, Gen-AlEx, GENEPOP, GeneClass, Genetic Studio, MicroSat, PowerMarker, которые широко применяют в сельскохозяйственной генетике.

Цель нашей работы заключалась в изучении полиморфизма 30 микросателлитных маркеров у шести локальных популяций крупного рогатого скота.

Методика. Проанализировали ДНК, выделенную из образцов крови 238 животных следующих локальных породных популяций: холмогорской (ПЗ «Архангельский», Холмогорский р-н, Архангельская обл.), печорского типа холмогорского скота (племхоз «Ухта-97», г. Ухта, Республика Коми), серого украинского скота (подсобное хозяйство Киевско-Печерской Лавры, Бориспольский р-н, Украина), истобенской (ПСХК «Истобенский», Оричевский р-н, Кировская обл.), суксунской (ТОО «Савинское», Суксунский р-н, Пермская обл.) и ярославской (хозяйство «Савинское» и ОПХ «Тутаево», Тутаевский р-н, Ярославская обл.).

Использовали 30 микросателлитных маркеров: BM1824, BM2113, BM1818, CSRM60, CSSM66, ETH3, ETH10, ETH152, ETH185, ETH225, HAUT24, HAUT27, HEL1, HEL5, HEL9, HEL13, INRA023, INRA032, INRA035, INRA037, INRA063, ILSTS005, ILSTS006, MM122, INRA005, SPS115, TGLA227, TGLA126, TGLA122, TGLA53.

ДНК выделяли стандартным фенольным методом (9). Полученную ДНК и праймеры разбавляли до концентрации соответственно 10 нг/мкл и 10 пмоль/мкл деионизированной водой. Условия проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) были взяты из базы данных Рослинского института (Великобритания). Микросателлиты с резко различающейся длиной аллелей анализировали по парам. Продукты ПЦР разделяли в 6 % полиакриламидном геле. Длину микросателлитов измеряли на приборах ALF Express automated DNK sequencer («Pharmacia», Швеция) и MegaBACE™ 500 DNA sequencer («Amersham Biosciences», США). Для идентификации аллелей микросателлитных локусов использовали программу ALF Win Fragment Analyser 1.00.36. Точную длину аллеля определяли сопоставлением с размерами аллелей у маркерных животных. В результате получали графики, по расположению пиков которых устанавливали длину микросателлита (п.н.).

Каждый локус оценивали по длине, числу аллелей, наблюдаемой и ожидаемой гетерозиготности, F_is -коэффициенту, внутрипопуляционный полиморфизм — по общему числу выявленных аллелей, наблюдаемой и ожидаемой гетерозиготности (несмещенная оценка), среднему числу аллелей на локус, числу частных и эффективных аллелей, F_is-коэффициенту с учетом доверительного интервала.

Для статистического анализа данных использовали программы GE-NEPOP, Genetix, Convert, а также собственные апробированные компьютерные программы, разработанные на основе известных математических моделей (10, 11).

Результаты. При анализе 30 микросателлитов, расположенных на 21 паре хромосом (1-й, 2-й, 3-й, 5-й, 7-й, 8-й, 9-й, 10-й, 11-й, 12-й, 14-й, 15-й, 16-й, 17-й, 18-й, 19-й, 20-й, 21-й, 22-й, 23-й и 26-й), полиморфизм выявили по всем локусам (табл. 1).                                                                                                                                                  

   
Разные микросателлиты имели неодинаковое максимальное число аллелей — от 3 (ILSTS005) до 17 (TGLA122, TGLA53). Микросателлит  ILSTS005 разработан для зебувидного скота, у которого наблюдали пять аллелей (12). Всего при анализе 30 микросателлитных локусов мы обнаружили 268 аллелей. Ожидаемая гетерозиготность оказалась достаточно высокой у всех микросателлитов (0,6122-0,8840), кроме INRA035 (0,4645) и ILSTS005 (0,3871). Микросателлит INRA035 показал довольно тесный инбридинг. Коэффициент F_is , характеризующий степень уменьшения наблюдаемой гетерозиготности по сравнению с ожидаемой, в случае INRA035  был равен +0,509 в сумме по всем популяциям. Только для одного микросателлита (ММ12) F_is имел отрицательное значение (-0,014), что указывало на слабый аутбридинг, для остальных он был слабо положительным.

Анализ генетического равновесия по Харди-Вайнбергу с помощью точного метода и поправки Бонферрони выявил достоверные отклонения частоты генотипов у микросателлита INRA035 в четырех исследуемых популяциях: суксунской (Р < 10^-4), ярославской (Р < 10^-4), холмогорской (Р = 3×10^-4) и печорского типа холмогорского скота (Р = 10^-3), поскольку при 30 локусах критический уровень значимости индивидуальных тестов не должен превышать величину 0,0017, чтобы считаться значимым на уровне 0,05 %. В истобенской и серой украинской породных популяциях Р-значения были равны соответственно 0,0051 и 0,0541.

Все популяции различались по числу выявленных аллелей — от 152 до 194 (табл. 2). Среднее число аллелей на локус по 30 микросателлитам составило 8,93. По данным литературы, среднее число аллелей на локус у немецких симменталов равно 6,64, у шведских голштинов — 6,52 при  анализе 25 микросателлитных маркеров из этого же списка (5), у черно-пестрого скота — 9,00 при анализе 7 микросателлитов  с наибольшим числом аллелей, причем разброс по длине аллелей микросателлитов был больше: TGLA227 — 75-105, ETH225 — 132-160, ETH10 — 207-231, BM1818 — 248-278, BM2113 — 151-155, BM1824 — 176-196 и SPS115 — 234-258 п.н. (13). При равном числе аллелей микросателлита их длина в разных популяциям была неодинаковой. Так, у животных ярославской и серой украинской пород обнаружили по пять аллелей микросателлита BM1824 размером соответственно 179, 181, 183, 189, 191 и 179, 181, 183, 187, 189 п.н. При этом аллели длиной 187 и 191 п.н. оказались породоспецифичными: первый был выявлен у животных серой украинской породы и не встречался у животных ярославской, второй — регистрировали у животных ярославской породы и не наблюдали у серой украинской.

Большой интерес представляют уникальные аллели, встречающиеся только в одной популяции. В суксунской популяции мы выявили 7 таких аллелей, в истобенской — 5, ярославской — 13, холмогорской — 6, у серого украинского скота — 12 и у печорского типа холмогорского скота — 1. Животные серой украинской породы практически не уступали животным ярославской по числу уникальных аллелей. Возможно, в процессе эволюции породы ее длительное разведение в небольшой ограниченной популяции с вынужденными родственными спариваниями обусловило выработку механизмов, препятствующих сужению генетической изменчивости. На это указывает анализ наследования аллелей В-системы групп крови в генофондном стаде серого украинского скота племзавода «Поливановка» (14). Так, вместо теоретически ожидаемых 28 % гомозигот от планируемого подбора фактически было получено 18 %. Наряду с этим в стаде были зафиксированы внутригенные рекомбинации, результатом которых стало появление новых аллелей (15, 16).

Число эффективных аллелей на локус, вносящих основной вклад в результат расчета гомо- и гетерозиготности, в породных популяциях КРС варьировало незначительно: от 2,86 (серая украинская) до 3,33 (суксунская) (см. табл. 2). По наблюдаемой и ожидаемой гетерозиготности, а также по среднему числу аллелей на локус различий мы не выявили. Коэффициент инбридинга (F_is) отражал несущественное преобладание гетерозиготных аллелей (в сумме по всем локусам) в истобенской (-0,0104) и ярославской (-0,0163) популяциях, в остальных отмечали невысокие положительные значения (суксунская популяция — +0,0125, холмогорская — +0,0180, печорский тип холмогорского скота — +0,0088 и серый украинский скот — +0,0040), что свидетельствовало о некотором преобладании гомозиготных аллелей. Для всех групп животных значения Fis находились в пределах доверительного интервала (95 %), что подтверждало отсутствие как инбридинга, так и аутбридинга, то есть изученные популяции имеют устойчивую генетическую структуру. 

Таким образом, у всех шести изученных локальных породных популяций при анализе 30 микросателлитных маркеров обнаружен широкий полиморфизм по длине аллелей. Во всех популяциях имеются уникальные аллели микросателлитов, а показатели наблюдаемой, ожидаемой гетерозиготности, Fis-коэффициент свидетельствуют об устойчивой генетической стру-ктуре (достоверно не проявляется ни инбридинг, ни аутбридинг). Полиморфизм микросателлитных маркеров уже используется в селекционной работе. Выпущены коммерческие наборы (ДНК-тесты) для выявления животных с лучшими показателями нежности и мраморности мяса в скотоводстве (http://www.bovigen.com, http://www.idenity.com, http://www.nbcec.org).

Л И Т Е Р А Т У Р А

1. G o l i d j o w  C.D.,  G i o v a m b a t t i s t a  G.,  R i p o l i  M.V.,  
D u l o u t  F.N.,  L o j o  M.M. Genetic variability and population structure structure in loci related to milk production traits in native Argentine Creole and commercial Argentine Holstain cattle. Genet. Mol. Biol., 22(3): 395-398.
2. K a n t a n e n  J.,  O l s a k e r  I.,  H o l m  L.-E. e.a. Genetic diversity and population structure of 20 north European cattle breeds. J. Heredity, 2000, 91: 446-457.
3. H a l l  S.J.G.,  B r a d l e y  D.G. Conserving livestock breed biodiversity. Trends Ecol. & Evol., 1995, 10(7): 267-270.
4. N o t t e r  D.R. The importance of genetic diversity in livestock population of the future. J. Animal Sci., 1999, 77: 61-69.
5. G r z y b o w s k i  G.,  P r u s a k  B. Genetic variation in nine European cattle breeds as determined on the basis of microsatellite markers. III. Genetic integrity of the Polish Red cattle included in the breeds preservation programme. Animal Sci. Papers and Reports, 2004, 22(1):  45-46.
6. V e l m a l a  R.J.,  V i l k k i  H.J.,  E l o  K.T. A search for quantitative trait loci for milk production traits on chromosome 6 in Finnish Ayrshire cattle. Animal Genet., 1999, 30(2): 136-143.
7. G u t i e r r e z - G i l  B.,  W i e n e r  P.,  N u t e  G.R. e.a. Detection of quantitative trait loci for meat quality trates in cattle. Animal Genet., 2008, 39: 51-61.
8. B r a d l e y  D.G. Genetic diversity in cattle. Proc. ISAG meeting. Tours, France, 1996 (http://www.projects.roslin.ac.uk/cdiv/markers.html).
9. S a m b r o o k  J.,  F r i t s c h  E.F.,  M a n I a t i s  T. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989.
10. Х е д р и к  Ф. Генетика популяций. М., 2003.
11. W e i r  B.S. Genetic data analysis II. Sunderland, USA, 1996.
12. P a n d e y  A.K.,  S h a r m a  R.,  S i n g h  Y. e.a. Genetic diversity studies of Kherigarh cattle based on microsatellite markers. J. Genet., 2006, 85(2): 117-122.
13. Ж и в о т о в с к и й  Л.А. Популяционная биометрия. М., 1991.
14. М и л о ф е е в а  Л.А. Разработка мультилокусной системы генетического анализа крупного рогатого скота по микросателлитам и ее использование для характеристики аллелофонда черно-пестрого скота. Автореф. канд. дис. Дубровицы, 2009.
15. Э й с н е р  Ф.Ф.,  В л а с о в  В.И.,  П о д о б а  Б.Е. Генетические проблемы селекции крупного рогатого скота. Вест. с.-х. науки, 1985, 3: 73-81.
16. П о д о б а  Б.Е.,  М и с о с т о в а  Н.В. Рекомбинации в локусе В групп крови крупного рогатого скота. Науч.-техн. бюл. НИИ животноводства Лесостепи и Полесья УССР (Киев), 1974, 11: 43-46.

THE ANALYSIS OF 30 MICROSATELLITE MARKERS IN LOCAL CATTLE POPULATIONS

T.Y. Kiselyova¹, B.Y. Podoba², Y.Y. Zabludovskiy², V.P. Terletskiy¹, N.I. Vorobyev¹, J. Kantanen³

An artificial insemination used in commercial cattle breeds has resulted in a loss of genetic diversity. Local cattle breeds may possess unique alleles and their combinations as a result of adaptation to different environmental challenges. Microsatellite markers are widely used for population genetic studies of cattle. 30 microsatellite markers (BM1824, BM2113, BM1818, CSRM60, CSSM66, ETH3, ETH10, ETH152, ETH185, ETH225, HAUT24, HAUT27, HEL1, HEL5, HEL9, HEL13, INRA023, INRA032, INRA035 INRA037, INRA063, ILSTS005, ILSTS006, MM122, INRA005, SPS115, TGLA227, TGLA126, TGLA122, TGLA53) in 238 individuals from 6 local cattle populations (Suksun, Istoben, Yaroslavl, Kholmogory, Grey Ukrainian and Pechora type of Kholmogory) were analyzed. In total, 268 alleles were detected from the 30 loci surveyed. Each locus was characterized according to its length, number of alleles, expected heterozygosity, F_is criterion. Genetic estimation of each population was carried out according to total and mean number of alleles, number of private and effective alleles, observed and expected (unbiased) heterozygosity, F_is criteria and interval confidence (IC). As a result wide polymorphism was revealed both in the loci and the populations studied. All populations had stable genetic structure.

Key words: microsatellite markers, alleles, local breeds, cattle.

Оформление электронного оттиска