УДК 636.5.033:636.082.12:575.113:57.08

ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ТРАНСФОРМАЦИЯ КЛЕТОК КУР in vitro И in vivo
С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ РЕТРОВИРУСНЫХ ВЕКТОРОВ

Н.А. ВОЛКОВА2, Е.К. ТОМГОРОВА2, В.А. БАГИРОВ1,2, Д.В. БЕЛОГЛАЗОВ2, Н.А. ЗИНОВЬЕВА2, Л.А. ВОЛКОВА2, Л.К. ЭРНСТ1

Исследовали факторы, влияющие на эффективность трансгенеза при переносе экзогенной ДНК в клетки кур ретровирусными векторами pBMN-lacZ и pLN-GFP в зависимости от количества и способа подготовки генной конструкции (вирусный препарат и применение клеток-упаковщиц), а также вида клеток-мишеней и стадии развития эмбриона. Частота генетической трансформации клеток-мишеней составила 1x10-3-5x10-3. Получены трансгенные куры с интеграцией и экспрессией гена GFP.

Ключевые слова: клеточная инженерия, трансгенез, ретровирусные векторы, трансгенные куры.

Key words: cell engineering, transgenesis, retrovirus vectors, transgenic chicken.

 

В последние годы все большее внимание исследователей уделяется проблеме получения трансгенной птицы, что открывает перспективы производства рекомбинантных белков со сложной структурой, которые могут синтезироваться только в клетках позвоночных (1-4). Существенные физиологические различия между птицами и млекопитающими представляются значительным преимуществом использования птицы в качестве продуктивной платформы.

Птица иммунна к потенциальным терапевтическим протеинам (например, к эритропоэтину человека), экспрессия которых может негативно влиять на трансгенных млекопитающих, продуцирующих такие лекарства на коммерческом уровне. Использование трансгенной птицы существенно снижает стоимость и увеличивает продуктивную мощность производства по сравнению с другими методами — микробиологической ферментацией Escherichia coli, дрожжей или применением культуры клеток млекопитающих (5, 6). Так, по оценкам специалистов при уровне экспрессии 2 мг/мл стоимость 1 г сырого рекомбинантного белка составит около 350 руб., что в 10-100 раз ниже, чем при производстве белков остальными существующими в настоящее время способами.

Вместе с тем создание трансгенной птицы осложнено особенностями репродуктивной биологии, что связано прежде всего с затруднениями при точном определении срока овуляции, наличием большого количества желтка в яйцеклетке, значительным уплотнением цитоплазмы около пронуклеусов. Поэтому традиционный метод получения трансгенных животных (микроинъекция ДНК в пронуклеус зигот) в этом случае малоэффективен. Следовательно, требуется поиск и разработка альтернативных приемов переноса экзогенной ДНК, к числу которых относится использование векторов на основе рекомбинантных ретровирусов, характеризующихся высокой эффективностью трансформации клеток-мишеней (в том числе соматических клеток) (7, 8). Последним обстоятельством обусловлена актуальность применения этих векторов как при трансформации эмбрионов, так и при генетической модификации органов, в частности семенников и яйцевода кур.

В этой связи целью нашей работы было изучение эффективности использования ретровирусных векторов для генетической модификации кур кросса Птичное.

Методика. В работе использовали два ретровирусных вектора pBMN-lacZ (предоставлен А.Б. Судариковым, Гематологический центр, г. Москва) и pLN-GFP (предоставлен к.б.н. И.К. Фоминым, Институт генетики и цитологии НАН Беларуси), содержащих соответственно репортерные гены lacZ (b-лактозидаза) и GFP (зеленый флюоресцирующий белок), поставленные под контроль промотора цитомегаловируса человека (CMV). Для упаковки векторов в вирусные частицы применялись две линии клеток-упаковщиц — pg13 (вектор pBMN-lacZ) и GP+envAm12 (вектор pLN-GFP).

Трансформацию клеток кур in vitro осуществляли посредством совместного культивирования с клетками-упаковщицами и инфицирования вирусным препаратом, представляющим собой среду культивирования клеток-упаковщиц, содержащую рекомбинантный ретровирус (9). Частоту генетической трансформации определяли как отношение числа полученных генетически трансформированных клонов к общему числу инфицированных клеток.

Введение генных конструкций в клетки эмбрионов кур in vivo выполняли в разные периоды эмбриогенеза. В качестве источника генных конструкций использовали как вирусный препарат (содержание вирусных частиц в неконцентрированном препарате 1×105 КОЕ/мл), так и суспензию клеток-упаковщиц (500-2000 клеток на эмбрион, вводимый объем — 1-100 мкл).

Интеграцию генной конструкции регистрировали с помощью ПЦР. Выделение ДНК из эмбрионов, органов и тканей птицы, проведение ПЦР-анализа осуществляли по ранее разработанным методикам (10).

Экспрессию экзогенной β-галактозидазы оценивали с использованием гистохимического анализа. Исследуемые образцы фиксировали в течение 1 ч при температуре 4 °С в 0,2 % глютаральдегиде, промывали 3 раза (по 30 мин) в ФСБ (фосфатно-солевой буфер, рН 7,4) при комнатной температуре и помещали в окрашивающий раствор (5 мМ K3[Fe(CN)6], 5мМ K4[Fe(CN)6], 2мМ MgCl2, 0,1 % Тритон Х-100 в ФСБ) на 48 ч при 37 °С. Дофиксацию материала проводили в 10 % растворе формалина в течение 48 ч.

Гистологические препараты готовили по общепринятой методике (11). Срезы получали на ротационном микротоме («TermoShandon», Великобритания). Препараты просматривали под микроскопом («Opton», Германия) и документировали с использованием компьютерной программы Image Scope (ООО «Системы для микроскопии и анализа», Россия).

Результаты. При оценке тропности ретровирусных генных конструкций в экспериментах с клеточной культурой in vitro и одним из используемых в работе векторов — pLN-GFP была показана эффективность переноса как для эмбриональных клеток, так и для клеток семенника и яйцевода. Частота генетической трансформации клеток-мишеней варьировала в зависимости от используемого источника генных конструкций (клетки-упаков-щицы или вирусный препарат). Наибольшее число клонов, в которых наблюдалась экспрессия репортерного гена GFP (3×10-3-5×10-3), получили при совместном культивировании клеток-мишеней с клетками-упаковщицами. При инфицировании вирусным препаратом частота трансформации была в 2-3 раза ниже и варьировала в зависимости от вида клеток-мишеней (эмбриональные клетки, клетки семенника и клетки яйцевода) от 1×10-3 до 2,5×10-3. Наибольшую долю трансформированных клонов отмечали в варианте с эмбриональными клетками (до 5×10-3), что связано с их высокой пролиферативной активностью. При трансформации клеток семенника и яйцевода эффективность трансформации достигала 3×10-3-4×10-3.

1. Эффективность генетической трансформации эмбрионов кур кросса Птичное in vivo с использованием ретровирусного вектора pLN-GFP под влиянием различных факторов в зависимости от варианта опыта

Показатель

I вариант

II вариант

ВП (1x105 КОЕ/мл)

концентрированный ВП

клетки-упаковщицы

x20

x100

Срок введения от начала инкубации, сут

0-е

1-е

2,5-е

2,5-е

2,5-е

2,5-е

2,5-е

2,5-е

Количество генных конструкций:
   мкл/эмбрион
   кл/эмбрион

 

100

 

1-2

 

1-2

 

1-2

 

1-2

 

500

 

1000

 

2000

Способ введения

А

Б

В

В

В

В

В

В

Проколото эмбрионов, шт.

30

30

30

28

30

40

50

30

Развилось эмбрионов, n (%)
В том числе трансгенных, n

24 (80)
6

18 (60)
7

21 (71)
10

17 (60)
6

14 (47)
5

30 (75)
14

37 (74)
24

12 (40)
2

Вылупилось цыплят, n (%)
В том числе трансгенных, n

9 (30)
1

3 (10)
2

4 (13)
2

4 (14)
1

3 (10)
1

9 (23)
3

11 (22)
4

3 (10)
0

Частота интеграции, %*

25,0

38,9

47,6

35,3

35,7

46,7

64,9

16,7

Эффективность трансгенеза, %**

20,0

23,3

33,3

21,4

16,7

35,0

48,0

6,7

Эффективность получения трансгенных кур, %***

3,3

6,7

6,7

3,6

3,3

7,5

8,0

0

П р и м е ч а н и е. ВП — вирусный препарат; А, Б и В — введение соответственно вблизи зародышевого диска, в эмбрион и в дорсальную аорту.
*, ** и *** Отношение соответственно числа полученных трансгенных цыплят и эмбрионов к числу развившихся эмбрионов, числа полученных трансгенных цыплят и эмбрионов к числу инъецированных эмбрионов, числа вылупившихся трансгенных цыплят к числу инъецированных эмбрионов.

Исходя из результатов, полученных in vitro, в опытах по трансформации in vivo в качестве клеток-мишеней выбрали эмбриональные клетки и введение генных конструкций осуществляли непосредственно в куриные эмбрионы.


Рис. 1.Электрофореграмма продуктов ПЦР-анализа ДНК, выделенной из органов и тканей трансгенного петуха (кросс Птичное), полученного при трансформации эмбриона генной конструкцией: 1 — селезенка, 2 — мышцы, 3 — легкие, 4 — сердце, 5 — почки, 6 — печень, 7 — кишечник, 8 — семенник, 9 — отрицательный контроль (ДНК интактной курицы), 10 — положительный контроль (ДНК генной конструкции).

При оптимизации процесса переноса генов оценили влияние двух групп факторов: метода и стадии развития при введении рекомбинантных векторов, а также количества генных конструкций и способа их подготовки. Введение рекомбинантных векторов (вирусный препарат) в эмбриональные клетки кур до инкубации яиц вблизи зародышевого диска, на 1-е сут инкубации непосредственно в эмбрион и на 3-и сут инкубации в дорсальную аорту показало, что наибольшая доля трансгенных эмбрионов от числа развившихся достигалась при генно-инженерных манипуляциях с эмбрионами на более поздних стадиях развития (табл. 1) — 47,6 %, что почти в 2 раза выше, чем при введении вектора на стадии зародышевого диска. Эффективность получения трансгенных кур (доля трансгенных особей от числа проинъецированных эмбрионов) также была выше в первом варианте и составила для неинкубированных яиц 3,3 %, для эмбрионов на 1-е и 3-и сут инкубации — по 6,7 %.

Необходимо отметить, что в результате трансформации эмбрионов были получены трансгенные куры-мозаики ввиду того, что ретровирусный вектор вводили в многоклеточный эмбрион. У 5-суточных эмбрионов экспрессия репортерного гена GFP наблюдалась преимущественно в первичной почке, печени и гонадах, на более поздних стадиях развития — в клетках печени, сердца, желудка, кишечника, мышц и репродуктивных органах. Причем трансформация гонад происходила преимущественно при введении вирусного препарата в дорсальную аорту 2,5-суточных эмбрионов, на основании чего в дальнейшем генные конструкции переносили на этой стадии развития эмбрионов.


Рис. 2. Экспрессия репортерных генов GFP (а) и lacZ (б) в органах и тканях трансгенных кур кросса Птичное (получены при трансформации эмбрионов конструкциями pBMN-lacZ и pLN-GFP): А — сердце, Б — печень, В — кишечник, Г — семенник. Увеличение ½400.

Сравнение эффективности трансформации при использовании концентрированного (20- и 100-кратного) вирусного препарата и суспензии клеток-упаковщиц (500, 1000 и 2000 клеток/эмбрион), предварительно блокированных митомицином С (в каждом варианте проинъецировали от 28 до 50 эмбрионов) показало, что высокую результативность обеспечивает применение клеток-упаковщиц (1000 клеток/эмбрион): экспрессию гена GFP регистрировали у 20,0 % инъецированных эмбрионов при эффективности получения трансгенных кур до 8,0 %. В вариантах с вирусным препаратом (содержание частиц различалось в 5 раз), а также клетками-упа-ковщицами (500 и 2000 клеток/эмбрион) этот показатель составил соответственно 3,6; 3,3; 7,5 и 0 % (см. табл. 1).

Таким образом, более высокая эффективность трансгенеза была установлена при введении ретровирусных векторов в дорсальную аорту 2,5-суточных эмбрионов кур с использованием клеток-упаковщиц (500-1000 клеток/эмбрион).

Введение ретровирусных векторов pBMN-lacZ и pLN-GFP в дорсальную аорту 2,5-суточных эмбрионов кур (n = 80-100) in vivo с клетками-упаковщицами (1000 клеток/эмбрион) продемонстрировало, что эффективность переноса экзогенной ДНК обоих векторов была практически одинаковой: доля трансгенной птицы от числа проинъецированных эмбрионов — 8,0-8,7 % (табл. 2).

Интеграция рекомбинантной ДНК происходила преимущественно в клетках печени, сердца, кишечника, желудка, репродуктивных органов, а также мышечной ткани (рис. 1) при практически одинаковом характере экспрессии рекомбинантных белков в вариантах с разными ретровирусными векторами (рис. 2).

2. Сравнительная характеристика эффективности трансформации эмбрионов кур кросса Птичное in vivo двумя ретровирусными векторами при использовании в качестве источника генных конструкций клеток-упаковщиц

Показатель

Опыт

Контроль

Генная конструкция

pBMN-lacZ

pLN-GFP

 

Заложено на инкубацию яиц, шт.

100

80

40

Объем введенной суспензии клеток-упаковщиц, мкл (число клеток в 1 мкл)

1 (1000)

1 (1000)

 

Развилось эмбрионов, n (%)
В том числе трансгенных, n

62 (62,0)
43

56 (70,0)
38

36 (91,0)

Вылупилось цыплят, n (%)
В том числе трансгенных, n

12 (12,0)
8

15 (18,8)
7

30 (75,0)

Частота интеграции, %*

69,4

67,9

 

Эффективность трансгенеза, %**

43,0

47,5

 

Эффективность получения трансгенных кур, %***

8,0

8,7

 

*, ** и *** То же, что в таблице 1.

Итак, оптимизированная нами технология переноса экзогенной ДНК в эмбрионы кур позволяет осуществить эффективную генетическую трансформацию in vivo и получать трансгенную птицу.

Л И Т Е Р А Т У Р А

1. K a m i h i r a  M.,  N i s h i j i m a  K.,  I i j i m a  S. Transgenic birds for the production of recombinant proteins. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol., 2004, 91: 171-189.
2. K a m i h i r a  M.,  O n o  K.,  E s a k a  K. e.a. High-level expression of single-chain Fv-Fc fusion protein in serum and egg white of genetically manipulated chickens by using a retroviral vector. J. Virol., 2005, 79: 10864-10874.
3. K i i e s  W.A.,  N i e m a n n  H. The contribution of farm animals to human health. Trends Biotechnol., 2004, 22: 286-294.
4. R a p p  J.C.,  H a r v e y  A.J.,  S p e k s n i j d e r  G.L. e.a. Biologically active human interferon alpha-2b produced in the egg white of transgenic hens. Transgenic Res., 2003, 12: 569-575.
5. I v a r i e  R. Avian transgenesis: progress towards the promise. Trends Biotechnol., 2003, 21: 14-19.
6. H a r v e y  A.J. Expression of exogenous protein in the egg white of transgenic chickens. Nat. Biotechnol., 2002, 20: 396-399.
7. Т и т о в а  В.А.,  В о л к о в а  Н.А.,  З и н о в ь е в а  Н.А. и др. Использование ретровирусных векторных систем для получения рекомбинантных белков в молоке сельскохозяйственных животных. С.-х. биол., 2002, 6: 53-58.
8. Э р н с т  Л.К.,  В о л к о в а  Н.А.,  З и н о в ь е в а  Н.А. Некоторые аспекты использования трансгенных технологий в животноводстве. С.-х. биол., 2009, 2: 4-9.
9. Новое в клонировании ДНК. Методы /Под ред. Д. Гловера. М., 1989.
10. З и н о в ь е в а  Н.А.,  П о п о в  А.Н.,  Э р н с т  Л.К. и др. Методические рекомендации по использованию метода полимеразной цепной реакции в животноводстве. Дубровицы, 1998.
11. Микроскопическая техника: Руководство /Под ред. Д.С. Саркизова, Ю.П. Перова. М., 1996.

 

EFFECTIVE TRANSFORMATION OF CHICKEN CELLS in vitro AND in vivo BY GENE CONSTRUCTION ON THE BASIS OF RETROVIRAL VECTORS

N.A. Volkova2, E.K. Tomgorova2, V.A. Bagirov1,2, D.V. Beloglazov2, N.A. Zinov’eva2, L.A. Volkova2, L.K. Ernst1

The authors investigated the efficiency of the recombinant DNA transfer into the chicken embryonic cells in vitro and in vivo using the pBMN-lacZ and pLN-GFP retroviral vectors in connection with features of gene construction (viral preparation, use of cells-packers), and also type of target cells and embryo development stage. The genetic transformation frequency of targeting cells was observed at the level of 1х10-3 to 5х10-3. The transgenic chickens with integration and expression of GFP gene were produced.

Key words: cell engineering, transgenesis, retrovirus vectors, transgenic chicken.

1Российская академия сельскохозяйственных наук,
117218 г. Москва, ГСП-7, ул. Кржижановского, 15, корп. 2;
2ГНУ Всероссийский НИИ животноводства
Россельхозакадемии
,
142132 Московская обл., Подольский р-н, пос. Дубровицы,
e-mail: natavolkova@inbox.ru

Поступила в редакцию
25 сентября 2009 года

 

Оформление электронного оттиска

назад в начало