УДК 636.3.033:575.22:575.17:577.2

АНАЛИЗ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИЗМЕНЧИВОСТИ И ФИЛОГЕНЕТИЧЕ-СКИХ СВЯЗЕЙ У ПОПУЛЯЦИЙ ТУВИНСКОЙ КОРОТКОЖИРНОХВОСТОЙ ОВЦЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ISSR-МАРКЕРОВ

Ю.А. СТОЛПОВСКИЙ1, Л.В. ШИМИИТ2, Н.В. КОЛ1, А.Н. ЕВСЮКОВ1, М.Н. РУЗИНА1, О.И. ЧУРГУЙ-ООЛ3, Г.Е. СУЛИМОВА1

С использованием ISSR-PCR (inter simple sequence repeats) маркеров исследовали популяции овец тувинской короткожирнохвостой породы в 18 генофондных и племенных хозяйствах Республики Тыва. Определены генетические параметры изменчивости и филогенетические связи между внутрипородными группами. Выявлены популяции, где сосредоточены типичные животные или наиболее сходные с усредненным генофондом тувинских овец. Полученные данные могут быть использованы при разведении и сохранении тувинских овец in situ.

Ключевые слова: межмикросателлитный анализ, генетическое разнообразие, генетическая структура, мониторинг, генофонд, консервация in situ.

 

Породообразование, возникновение породных ассоциаций, межгенные взаимодействия, формирование генетических параметров разнообразия, сохранение генетической изменчивости в отечественных породах остаются малоизученными областями частной генетики доместицированных видов. Использование ДНК-маркеров — одно из перспективных направлений исследования генома, позволяющее решать не только фундаментальные, но и практические задачи. Например, с помощью микросателлитного анализа были выявлены эволюционно-генетические связи у пород овец и некоторые исторические факты по их созданию (1). На основании результатов межмикросателлитного анализа у пород крупного рогатого скота оценили степень генетического разнообразия на уровне не только пород, но и стад, линий, а также маркировали их на геномном уровне (2, 3). Вследствие геномной изменчивости, которая выявляется с помощью метода ISSR (inter simple sequence repeats), можно получать ДНК-маркеры, имеющие множественную локализацию в геноме, и одновременно тестировать от 20 до 40 локусов. ISSR-фингерпринтинг показал, что распределение спектра продуктов ПЦР (PCR), полученных на основе ди- и тринуклеотидных повторов, специфично и высокоинформативно у растений, человека, диких и одомашненных животных (4-7). Выявляемые последовательности ДНК могут быть частью так называемых ген-специфических локусов, что, в свою очередь, открывает перспективы для поиска корреляций с количественными и качественными признаками.

Анализ уникальных последовательностей ДНК, которые располагаются между микросателлитами, имеет ряд несомненных преимуществ. Прежде всего, ISSR-PCR — относительно дешевый и простой экспресс-метод, не требующий знания нуклеотидной последовательности генома, что важно для исследования генофондов малоизученных видов, дающий возможность одновременно сравнивать десятки микросателлитных локусов, которые окружают многие гены. В связи с этим полиморфизм последовательностей ДНК, фланкированных инвертированными повторами, используют для определения генетической изменчивости, структуры, специфических геномных характеристик доместицированных видов, поиска филогенетических связей между породами и внутрипородными группами и т.п.

Для проведения исследований мы выбрали уникальную породу древнейшего происхождения с ярко выраженными генотипическими и фенотипическими особенностями — тувинскую короткожирнохвостую овцу.

Тувинская короткожирнохвостая овца представляет собой ценную локальную породу, которая создавалась на протяжении не менее 3000 лет. Она выведена племенами, жившими на территории современной Тывы (пример так называемого номадного животноводства), необычайно приспособлена к локальным природно-климатическим и пастбищно-кормовым условиям, кочевому образу жизни местного населения. Тувинская овца имеет сходство как с монгольскими, так и с курдючными овцами, сохраняя специфические особенности: выносливость, крепкий костяк, подвижность, способность быстро накапливать жир после зимы, вместо воды использовать снег, быстро передвигаться по степи и крутым горным склонам, неприхотливость к объемистым кормам, прекрасные материнские качества, пугливость и вместе с тем привязанность к стойбищу, окраску и экстерьер. Тувинская овца оказала влияние на формирование таких типов овец, как баятские, дорбетские, хоптогайтинские, урянхайские, которые резко отличаются от монгольской овцы.

Большинство тувинских овец имеют две основные масти: белую черноголовую (до 75 %) и черную. Тувинская короткожирнохвостая овца относится к мясошерстным грубошерстным породам. У взрослых овцематок живая масса, по данным И.Т. Кызыл-оол и Ч.Г. Оюнарова, составляет 51,5 кг, по данным А.И. Ерохина — 43,0-50,0 кг, по данным экспедиции ВАСХНИЛ — 49,4 кг, настриг шерсти — соответственно 1,0-1,6; 1,3-1,8 и 1,0-1,4 кг (8-10).

Современные исследования шерстной продуктивности тувинских овец показывают, что содержание волокон по морфологическим типам составляет: пуха — 83,9, переходного волоса — 6,7 и ости — 9,4 %. Тувинские овцы характеризуются невысоким настригом шерсти, типичным для многих грубошерстных пород. Овцематки в среднем дают 1,5-1,7 кг, бараны — 2,3-2,5 кг шерсти, шерсть грубая, неоднородная. Живая масса в среднем 38-41 кг, убойный выход — 44-46 %. В настоящее время в составе руна отмечается превышающая предельно допустимую норму доля сухого мертвого волоса. В некоторых отарах доля цветных овец больше, чем имеющих белую масть. Плодовитость маток невысокая — 104-110 %.

Тувинские овцы из-за географической изолированности основной территории Тывы в меньшей степени, чем другие локальные породы, подвергались скрещиваниям. Тем не менее, известны попытки повышения шерстной продуктивности скрещиванием с тонкорунными породами, в частности с красноярской, алтайской, каракульской, мериносами новокавказского типа и даже американскими рамбулье. Однако планомерная работа по преобразованию местного грубошерстного овцеводства в тонкорунное не дала заметных положительных результатов. Еще в 1930-1950-е годы было показано, что при разведении помесей грубошерстных овец с тонкорунными наблюдается увеличение отхода ягнят, появление большого числа животных с тонкой шерстью и ослабленной конституцией, резкое снижение количества жиропота и большая засоренность шерсти (11).

При межпородной гибридизации проявилось еще одно свойство номадной овцы: благодаря отличной приспособленности к местным условиям и устойчивым генным ассоциациям порода не превратилась в синтетическую популяцию. С помощью возвратного скрещивания во многих хозяйствах удалось восстановить генетическую структуру тувинской короткожирнохвостой овцы после 50 лет скрещивания с тонкорунными баранами.

На наш взгляд, наиболее реальный подход к улучшению тувинских овец — целенаправленная племенная работа при чистопородном разведении. Возможно использование баранов-производителей дархатской породы из Монголии, которую этнические тувинцы разводят в аймаке Хубсугул, граничащем с Тывой.

В настоящее время перед тувинскими селекционерами стоят задачи отбора и подбора желательного типа этих овец (животные с белой шерстью, в которой преобладает пух и ость при минимальной доле мертвого и сухого волоса) для восстановления и сохранения тувинской короткожирнохвостой породы. Изучение генома тувинской овцы поможет скорректировать селекционные планы и отбирать не только фенотипы, но и генотипы.

В связи с этим цель нашего исследования заключалась в оценке генетического разнообразия тувинской овцы, выявлении ее специфического геномного профиля, степени сходства и различия современных популяций с применением ISSR-маркеров.

Методика. Образцы крови овец, используемые для анализа, были получены из 18 хозяйств Тывы (проанализировано 1101 животное — 926 овцематок и 175 баранов-производителей). Для выявления маркеров полиморфизма фрагментов ДНК, фланкированных инвертированным повтором микросателлитного локуса (ISSR-PCR маркеры), использовали стандартный метод (12). Для проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) из образцов крови овец выделяли геномную ДНК, в качестве праймеров в реакционную смесь добавляли динуклеотидный микросателлитный фрагмент (AG)9C. ПЦР проводили на амплификаторе Терцик («ДНК-Технология», Россия) с применением набора сухих реагентов для ПЦР-амплификации ДНК GenePak™ PCR Core («Изоген», Россия). Условия ПЦР: первоначальная денатурация — 2 мин при 95 °С; денатурация при 95 °С 30 с, отжиг при 55 °С 30 с, элонгация при 72 °С 2 мин (37 циклов); завершающая элонгация при 72 °С 7 мин. Продукты амплификации фракционировали в 2 % агарозном геле с применением в качестве маркера молекулярных масс GeneRuler™ 100 bp DNA Ladder Plus («MBI Fermentas», США). Результаты документировали с помощью программы Vitran v.1.0 (Biokom, 2001-2002) под ультрафиолетовым излучением на трансиллюминаторе после окрашивания гелей бромистым этидием. Для определения размера продуктов амплификации использовали программу «OneDscan». Статистическую обработку данных осуществляли с помощью стандартных компьютерных программ Statistica 8.0, Popgene 1.32. Генетическое расстояние между внутрипородными группами определяли по M. Nei (13).

Результаты. С помощью ISSR-маркера (AG)9C были выявлены специфические спектры фрагментов ДНК с молекулярной массой от 2100 до 160 п.н. (всего 24 фрагмента). В представленной работе мы использовали фрагменты размером 300-1700 п.н. (21 фрагмент). В этой зоне фрагменты ДНК, в том числе специфичные для тувинских овец, стабильно и четко воспроизводились (рис. 1).

Мы обнаружили шесть типичных фрагментов ДНК тувинской короткожирнохвостой овцы по ISSR-маркерам (AG)9C, которые проявлялись


Рис. 1. Спектры фрагментов амплификации ДНК тувинской короткожирнохвостой овцы, полученных методом ISSR-PCR при использовании праймера (AG)9C: 1-7 — соответственно образцы от разных животных; а, б — объем образца соответственно 10 и 5 мкл (ГУП «Бай-Тал», Республика Тыва).

в геле единым блоком и встречались у большинства животных: фрагмент с молекулярной массой 750-720 п.н., двойной фрагмент — 630-600 и 590-560 п.н., а также фрагменты 490-470 и 430-410 п.н.; к категории породоспецифичных также можно отнести фрагмент с молекулярной массой от 1200 до 1150 п.н. (встречается с частотой более 95 %).
Описанные ампликоны можно назвать породоспецифичными весьма условно, так как, вероятно, мы имеем дело с видоспецифичными фрагментами ДНК для подвида домашней овцы (Ovisammonaries), потому что подобные спектры ISSR-маркеров мы ранее обнаружили у овец романовской породы (14).

Тем не менее, на фоне основных ампликонов породы (вида) тувинские овцы имеют специфический геномный профиль, который был рассчитан на основании средней частоты встречаемости фрагментов в 18 внутрипородных группах (рис. 2).


Рис. 2. Геномный профиль тувинской короткожирнохвостой овцы, рассчитанный на основании средней частоты встречаемости фрагментов у 18 внутрипородных групп. На ординате представлены градации частоты встречаемости фрагментов, на абсциссе фиксированные интервалы молекулярных масс изученных фрагментов.

Сведения о популяционных частотах фрагментов амплификации мы использовали для анализа параметров филогенетических связей, расчета сходства (генетических расстояний — DN) между популяциями тувинских овец и классического кластерного анализа, позволяющего оценить взаимоотношения внутри породных групп (рис. 3).

По данным кластерного анализа (табл. 1), в современной популяции тувинской короткожирнохвостой овцы наиболее типичные особи (соответствующие усредненному генофонду тувинской овцы) сосредоточены в хозяйствах ГУП «Бай-Тал» (генетическое сходство с тувинской овцой составило 0,997), ГУП «Моген-Бурен» (0,995), МУП «Чалааты» (0,933), ООО МТС «Кызыльская» (0,991), СПК «Биче-Тей» (0,990), ГУП «Малчын» (0,990), СПК «Бай-Хол» (0,989), ГУП «Чодураа» (0,989), ГУП «Торгалык» (0,989).

Наименьшее генетическое расстояние (DN) выявили между популяциями ГУП «Бай-Тал» и СПК «Бай-Хол» (0,011), наибольшее — между животными из популяций СПК «Дуза» и КФХ «Ондар» (0,130). Наименьшее генетическое расстояние относительно генофонда тувинской овцы имели особи из популяций ГУП «Бай-Тал» (0,030) и ГУП «Моген-Бурен» (0,050),  наибольшее — МУП «Деспен» (0,350) и СПК «Даг-Ужу» (0,350).


1. Показатели генетического расстояния (под диагональю) и генетического сходства (над диагональю) внутри породных групп тувинской короткожирнохвостой породы овец из разных хозяйств по маркеру (AG)9C


Популяция

СПК «Амерлан»

ГУП «Бай-Тал»

СПК «Бай-Хол»

СПК «Белдир»

СПК «Биче-Тей»

СПК «Даг-Ужу»

МУП «Деспен»

СПК «Дуза»

МУП «Малчын»

МУП «Мандала»

ГУП «Моген-Бурен»

КФГ «Ондар»

ГУП «Торгалыг»

МУП «Чалааты»

ГУП «Чодураа»

КФХ «Донгак»

СПК «Амык»

ООО МТС «Кызыльская»

Тувинская

СПК «Амерлан»

 

0,986

0,972

0,967

0,978

0,953

0,948

0,888

0,983

0,965

0,983

0,978

0,969

0,978

0,973

0,919

0,977

0,979

0,982

ГУП «Бай-Тал»

0,015

 

0,990

0,980

0,989

0,960

0,962

0,930

0,987

0,986

0,993

0,977

0,986

0,991

0,987

0,942

0,976

0,992

0,997

СПК «Бай-Хол»

0,028

0,011

 

0,987

0,991

0,941

0,949

0,921

0,984

0,983

0,991

0,970

0,992

0,991

0,984

0,950

0,977

0,993

0,989

СПК «Белдир»

0,034

0,021

0,013

 

0,978

0,961

0,957

0,922

0,988

0,977

0,988

0,949

0,983

0,990

0,969

0,961

0,961

0,980

0,983

СПК «Биче-Тей»

0,022

0,011

0,009

0,022

 

0,946

0,957

0,924

0,986

0,985

0,994

0,967

0,987

0,989

0,989

0,929

0,975

0,991

0,990

СПК «Даг-Ужу»

0,048

0,041

0,061

0,040

0,056

 

0,944

0,903

0,968

0,950

0,966

0,922

0,947

0,963

0,938

0,902

0,934

0,944

0,964

МУП «Деспен»

0,054

0,039

0,052

0,044

0,044

0,058

 

0,892

0,957

0,948

0,963

0,915

0,938

0,956

0,935

0,919

0,921

0,963

0,966

СПК «Дуза»

0,119

0,072

0,082

0,082

0,079

0,102

0,114

 

0,918

0,921

0,924

0,878

0,921

0,922

0,931

0,858

0,899

0,909

0,944

МУП «Малчын»

0,017

0,013

0,016

0,013

0,015

0,032

0,045

0,086

 

0,981

0,995

0,972

0,986

0,993

0,979

0,937

0,972

0,983

0,990

МУП «Мандала»

0,035

0,015

0,017

0,024

0,016

0,051

0,054

0,083

0,020

 

0,988

0,973

0,993

0,993

0,989

0,940

0,961

0,987

0,987

ГУП «Моген-Бурен»

0,017

0,007

0,009

0,012

0,006

0,035

0,037

0,079

0,005

0,013

 

0,969

0,991

0,996

0,987

0,936

0,977

0,990

0,995

КФГ «Ондар»

0,022

0,023

0,031

0,053

0,034

0,082

0,089

0,130

0,028

0,027

0,032

 

0,974

0,972

0,977

0,925

0,968

0,973

0,970

ГУП «Торгалыг»

0,032

0,014

0,009

0,017

0,013

0,055

0,064

0,082

0,014

0,008

0,009

0,026

 

0,997

0,991

0,945

0,978

0,985

0,989

МУП «Чалааты»

0,022

0,009

0,010

0,010

0,011

0,037

0,045

0,082

0,007

0,007

0,004

0,028

0,003

 

0,988

0,952

0,976

0,988

0,993

ГУП «Чодураа»

0,027

0,013

0,016

0,032

0,011

0,064

0,067

0,071

0,021

0,011

0,013

0,023

0,009

0,012

 

0,926

0,975

0,983

0,989

КФХ «Донгак»

0,085

0,060

0,051

0,040

0,074

0,103

0,084

0,153

0,066

0,062

0,066

0,078

0,057

0,049

0,077

 

0,924

0,947

0,938

СПК «Амык»

0,023

0,024

0,023

0,040

0,025

0,068

0,083

0,107

0,028

0,040

0,024

0,032

0,022

0,025

0,025

0,079

 

0,972

0,977

ООО МТС «Кызыльская»

0,021

0,008

0,007

0,020

0,009

0,058

0,037

0,096

0,017

0,014

0,010

0,027

0,015

0,012

0,017

0,055

0,029

 

0,991

Тувинская

0,018

0,003

0,011

0,017

0,010

0,037

0,035

0,058

0,010

0,013

0,005

0,030

0,012

0,007

0,011

0,065

0,023

0,009

 

 


Наибольшее генетическое сходство имели животные из популяций ГУП «Бай-Тал» (0,997), ГУП «Моген-Бурен» (0,995), МУП «Чалааты» (0,993) и ООО МТС «Кызыльская» (0,991).

Рис. 3. Дендрограмма, характеризующая генетические взаимоотношения внутри породных групп тувинской короткожирнохвостой овцы из разных хозяйств по маркеру (AG)9C в диапазоне длин фрагментов ДНК 300-2100 п.н. Деревья построены методом UPGA на основе генетических расстояний по M. Nei (13).

Полученные данные по генетическому сходству и различию в популяциях овец представляют интерес не только для частной генетики вида (породы), но имеют важное селекционное значение, так как позволяют выявить отары, где разводят типичных для породы животных, определить их родственные связи, изолированные и синтетические группы жи-вотных, оценить селекционный статус по породе в целом и предложить селекционную стратегию.

Молекулярно-генетический анализ показал, что на генофонд тувинской овцы наибольшее влияние оказывает селекционная практика трех государственных предприятий — ГУП «Моген-Бурен» (юго-запад Республики Тыва), МУП «Чалааты» (юг) и ООО МТС «Кызыльская» (центральная часть). Наиболее типичные для тувинской породы овцы сосредоточены также в хозяйстве ГУП «Бай-Тал».

Структура филогенетических деревьев, полученных с помощью UPGA на основе генетических дистанций, подтверждает эти выводы. Так, на дендрограммах сформировалось пять кластеров. Один основной объединял 14 популяций тувинской овцы, четыре других образовали животные из четырех хозяйств: СПК «Даг-Ужу», МУП «Деспен», КФХ «Донгак», СПК «Дуза» (см. рис. 3). Можно предположить, что поголовье именно этих четырех хозяйств в меньшей степени подвергалось скрещиваниям.

При более детальном анализе генетических взаимоотношений внутрипородных групп тувинской овцы четко выделились генетически близкие отары из СПК «Амырлан» и КФХ «Ондар», СПК «Бай-Хол» и ООО МТС «Кызыльская», ГУП «Малчын» и ГУП «Моген-Бурен», МУП «Чалааты» и ГУП «Торгалыг». Кроме того, обнаружилось несколько миникластеров генетически обособленных групп. Следовательно, в популяциях тувинской овцы сформировалось несколько генетически консолидированных групп, связанных между собой благодаря регулярному обмену овцематками и баранами-производителями, а также обособленные изолированные группы животных. Этот вывод подтверждают результаты оценки показателей генетического разнообразия (табл. 2).

В среднем по внутрипородным группам у тувинской овцы при ISSR-анализе праймер (AG)9C инициировал синтез 15 фрагментов в диапазоне от 300 до 2100 п.н. Из них число полиморфных в разных популяциях варьировало от трех (СПК «Амерлан», КФХ «Донгак») до 14 (МУП «Деспен» и СПК «Дуза») при уровне полиморфизма от 9,7 до 45,2 %.

В нашем исследовании число обнаруженных полиморфных локусов положительно коррелировало с общим генным (H — среднее генное разнообразие на локус) и внутрипопуляционным разнообразием (I — индекс разнообразия Шеннона). Известно, что чем больше полиморфных локусов, тем разнообразие выше. По обоим генетическим параметрам были получены сходные результаты. Так, наибольшие значения общего и внутрипопуляционного разнообразия выявили в популяции СПК «Дуза» и МУП «Деспен» (h — соответственно 0,147 и 0,130; I — 0,224 и 0,199), наименьшее — в отарах СПК «Амерлан» (0,025) и КФХ «Донгак» (0,043). Однако у внутрипородных групп с одинаковым уровнем полиморфизма (например, СПК «Даг-Ужу», СПК «Биче-Тей», МУП «Малчын», ООО МТС «Кызыльская» — 35,5 %) показатели генетического разнообразия различались. Полученные значения (I и h) свидетельствовали, что внутрипопуляционное разнообразие было выше в отарах МУП «Малчын» и ООО МТС «Кызыльская». Из этого следует, что средняя гетерозиготность по M. Nei (13) в популяции или внутрипопуляционное разнообразие по Шеннону не всегда зависят от уровня полиморфизма популяции в целом. У тувинской короткожирнохвостой породы овец средняя гетерозиготность составила 0,146, а индекс генетического внутрипопуляционного разнообразия по Шеннону оказался равен 0,234.

2. Показатели генетического разнообразия в популяциях короткожирнохвостой тувинской овцы

Внутрипородная группа

Na

Ne

N

%

h

I

PIC

СПК «Амык»

1,258
(0,061)

1,114
(0,037)

8

25,8

0,068
(0,020)

0,106
(0,029)

0,2645

СПК «Амерлан»

1,097
(0,039)

1,081
(0,033)

3

9,7

0,044
(0,018)

0,063
(0,025)

0,4549

ГУП «Бай-Тал»

1,387
(0,064)

1,201
(0,043)

12

38,7

0,119
(0,024)

0,180
(0,034)

0,3066

СПК «Бай-Хол»

1,290
(0,065)

1,189
(0,048)

9

29,0

0,108
(0,026)

0,158
(0,038)

0,3703

СПК «Белдир»

1,290
(0,068)

1,178
(0,050)

9

29,0

0,101
(0,027)

0,150
(0,038)

0,3475

СПК «Биче-Тей»

1,355
(0,074)

1,118
(0,037)

11

35,5

0,076
(0,022)

0,120
(0,033)

0,2132

СПК «Даг-Ужу»

1,355
(0,054)

1,156
(0,033)

11

35,5

0,094
(0,019)

0,145
(0,027)

0,2658

МУП «Деспен»

1,452
(0,062)

1,215
(0,040)

14

45,2

0,130
(0,023)

0,199
(0,033)

0,2887

КФХ «Донгак»

1,097
(0,040)

1,038
(0,017)

3

9,7

0,026
(0,011)

0,043
(0,018)

0,2728

СПК «Дуза»

1,452
(0,066)

1,242
(0,044)

14

45,2

0,147
(0,024)

0,224
(0,035)

0,3247

ООО МТС «Кызылская»

1,355
(0,055)

1,186
(0,038)

11

35,5

0,107
(0,021)

0,159
(0,030)

0,2999

МУП «Малчын»

1,355
(0,063)

1,191
(0,042)

11

35,5

0,114
(0,023)

0,172
(0,034)

0,3201

МУП «Мандала»

1,258
(0,060)

1,142
(0,036)

8

25,8

0,088
(0,022)

0,133
(0,032)

0,3390

ГУП «Моген-Бурен»

1,355
(0,049)

1,155
(0,028)

11

35,5

0,098
(0,016)

0,153
(0,024)

0,2755

КФХ «Ондар»

1,226
(0,055)

1,105
(0,034)

7

22,6

0,062
(0,019)

0,096
(0,027)

0,3191

ГУП «Торгалыг»

1,387
(0,064)

1,160
(0,037)

12

38,7

0,099
(0,021)

0,152
(0,032)

0,2804

МУП «Чалааты»

1,290
(0,062)

1,176
(0,043)

9

29,0

0,103
(0,024)

0,155
(0,035)

0,4032

ГУП «Чодураа»

1,323
(0,061)

1,129
(0,036)

10

32,3

0,079
(0,020)

0,124
(0,029)

0,2543

П р и м е ч а н и е. Обозначения: Na — среднее число аллелей на локус; Ne — эффективное число аллелей; N — число полиморфных локусов; % — доля полиморфных локусов; h — генетическое разнообразие; I — индекс разнообразия Шеннона; PIC – ожидаемая гетерозиготность; в скобках указана статистическая ошибка.

Наибольшее абсолютное число аллелей в среднем на локус также отмечали в популяциях, обладающих наиболее высоким уровнем полиморфизма, а в отарах с одинаковым уровнем полиморфизма число аллелей в среднем на локус не различалось. Известно, что эффективное число аллелей оценивает величину, обратную гомозиготности, и представляет собой такое число аллелей, при одинаковой частоте которых в популяции ожидаемая гетерозиготность будет равна фактической. Практически во всех популяциях эффективное число аллелей было ниже, чем абсолютное число аллелей на локус, что согласуется с результатами популяционных исследований у других видов животных и растений. Абсолютное число аллелей по всем популяциям тувинской овцы равнялось 1,677, эффективное число аллелей — 1,229.

Общее генетическое разнообразие (Ht) по M. Nei (15) можно разделить по уровням популяционной структуры — между особями внутри популяций (Hc), между популяциями внутри группы (Dcs) и между группами популяций (Dst), то есть Ht = Hc + Dcs + Dst. Тогда долю межгруппового разнообразия в общем будет отражать величина Gst = Dst/Ht, долю внутрипопуляционного разнообразия внутри групп — Gct = Dcs/Hs, долю внутрипопуляционного разнообразия среди особей — Hc/Ht. Трехуровневый анализ разнообразия и оценка долей Hc, Dcs, Dst в величине Ht показал, что у тувинской короткожирнохвостой овцы общее генетическое разнообразие (Ht) составило 0,125±0,006, внутрипопуляционное разнообразие (Нs) — 0,092±0,006, доля межпопуляционного разнообразия (Gst) — 0,260.

Межпопуляционная изменчивость у тувинской овцы оказалась выше внутрипопуляционной, и этот факт можно использовать для подбора и отбора при межпопуляционных или внутрипопуляционных скрещиваниях животных, разработке селекционных программ.

Мы рассчитали индекс PIC (polymorphiс information contents) по формуле для диаллельных локусов (16). Это возможно при условии, что по каждому локусу исследованная группа животных находится в равновесном состоянии согласно закону Харди-Вайнберга. Полученные величины PIC находились в пределах от 0,2132 (СПК «Биче-Тей») до 0,4590 (СПК «Амерлан»), что свидетельствует, с одной стороны, о достаточной информативности используемого ISSR-PCR маркера, с другой — о различном генетико-селекционном статусе в популяциях тувинской овцы. Расчет PIC по спектру продуктов амплификации, полученных с использованием в качестве праймера (AG)9C, показал достаточно высокий уровень ожидаемой средней гетерозиготности, который находится в пределах, рассчитанных ранее для романовской овцы (14).

По нашему мнению, зафиксированные с помощью ISSR-PCR метода показатели генетического разнообразия (доля полиморфных локусов в отдельных популяциях < 10 %, среднее на локус генное разнообразие — < 0,044, индекс разнообразия Шеннона — < 0,063, число аллелей в среднем на локус £ 1,097, эффективное число аллелей — от 1,038 до 1,081) могут косвенно свидетельствовать об инбредной депрессии в популяции или ее жесткой изоляции. Степень полиморфизма > 40 %, среднее на локус генное разнообразие > 0,140, индекс разнообразия Шеннона около 0,224, число аллелей в среднем на локус ≥ 1,452, эффективное число аллелей от 1,215 до 1,242 указывали на нивелирование влияния искусственного отбора при чистопородном разведении или наличие признаков синтетической популяции.

В заключение отметим, что систематическая племенная работа по улучшению тувинской овцы начата сравнительно недавно, поэтому изучаемую породу нельзя признать достаточно консолидированной. В связи с этим разработка мероприятий по улучшению и сохранению тувинской овцы в настоящее время весьма актуальны. Используя самцов из наиболее типичных стад для возвратных скрещиваний, во многих хозяйствах можно восстановить генетическую структуру тувинской короткожирнохвостой овцы, а с помощью молекулярно-генетических маркеров в дальнейшем контролировать ее при разведении или сохранении in situ.
Таким образом, с использованием молекулярно-генетических маркеров — фрагментов ДНК, фланкированных инвертированным повтором динуклеотидной микросателлитной последовательности (TC)9G, впервые получена информация о генетической структуре популяций тувинской короткожирнохвостой овцы и ее разнообразии на геномном уровне. Эти результаты свидетельствуют, что в геноме тувинской овцы сохранились устойчивые генные (породные) ассоциации, несмотря на многоэтапную породную гибридизацию, поглотительные и воспроизводительные скрещивания. На основании ISSR-анализа определены внутрипородные группы, оказывающие наибольшее влияние на селекционные процессы внутри тувинской породы овец, а также выявлены популяции, где сохранились наиболее чистопородные и гетерогенные животные локальной породы. Примененные нами статистические подходы могут использоваться для установления филогенетических связей, геномного профиля вида, породы, внутрипородной группы, а также мониторинга генетической структуры породы в целом для различных сельскохозяйственных животных. В связи с этим общеизвестный термин «маркерная селекция» может быть дополнен новым термином «молекулярная, или геномная селекция», в которой будет аккумулирован потенциал двух направлений современной науки, занимающихся исследованиями генотипической и фенотипической изменчивости домашних животных, — соответственно молекулярной генетики и зоотехнии.

Л И Т Е Р А Т У Р А

1. О з е р о в  М.Ю.,  Т а п и о  М.,  М а р з а н о в  Н.С. и др. Микросателлитный анализ эволюционно-генетических связей у различных пород овец. Докл. РАСХН, 2006, 2: 30-33.
2. С у л и м о в а  Г.Е.,  А х а н и  А з а р и  М.,  С т о л п о в с к и й  Ю.А. и др. Сравнительное исследование полилокусных спектров фрагментов ДНК, фланкированных участков микросателлитных локусов (ISSR-PCR) стад и линий ярославской породы крупного рогатого скота. В сб.: Научные основы повышения продуктивности сельскохозяйственных животных /Под ред. В.Е. Кремина. Ярославль, 2009: 159-163.
3. Г е н д ж и е в а  О.Б.,  С у л и м о в а  Г.Е. Изучение генетического разнообразия калмыцкого скота с использованием ISSR-фингерпринтинга. Зоотехния, 2009, 3: 4-5.
4. Г л а з к о  В.И.,  С т о л п о в с к и й  Ю.А.,  Ф е о ф и л о в  Ф.В. и др. Распределение фрагментов ДНК, фланкированных инвертированными повторами ди- и тринуклеотидных микросателлитов, в геномах серого украинского скота. Изв. ТСХА, 2009, 1: 155-162.
5. Ш а б р о в а  Е.В.,  Т а р с к а я  Л.А.,  М и к у л и ч  А.И. и др. Дифференциация близкородственных и отдаленных популяций человека на основе данных мультилокусного ДНК-фингерпринтинга. Генетика, 2003, 39(2): 236-243.
6. Г о р о д н а я  А.В.,  Г л а з к о  В.И. ISSR-PCR в дифференциации генофондов пород крупного рогатого скота. Цитология и генетика, 2003, 1: 61-67.
7. С у л и м о в а  Г.Е.,  С т о л п о в с к и й  Ю.А.,  Р у з и н а  М.А. и др. Мониторинг генофондов популяций животных в связи с задачами селекции и изучением филогении. В сб.: Биоразнообразие и динамика генофондов. М., 2008: 211-214.
8. К ы з ы л - о о л  И.Т. Овцеводство Тувинской АССР. Кызыл, 1978.
9. О ю н а р о в а  Ч.Г. Экстерьерные особенности тувинских короткожирнохвостых овец. Кызыл, 1998.
10. Е р о х и н  А.И.,  Е р о х и н  С.А. Овцеводство. М., 2004.
11. Ш у л ь ж е н к о  И.Ф. Животноводство Монгольской Народной Республики /Под ред. В.С. Немчинов. М.-Л., 1954.
12. Z i e t k i e w i c z  E.,  R a f a l s k i  A.,  L a b u d a  D. Genome fingerprinting by sequence repeat (SSR) — anchored polymerase chain reaction amplification. Genomics, 1994, 20: 176-183.
13. N e i  M. Genetic distance between populations. Amer. Nature, 1972, 949: 283-292.
14. С т о л п о в с к и й  Ю.А.,  Л а п ш и н  А.В.,  К о л  Н.В. и др. Полиморфизм молекулярно-генетических маркеров у овец романовской породы. Изв. ТСХА, 2008, 2: 125-134.
15. N e i  M. Molecular evolutionary genetics. N. Y., Columbia University Press., 1987.
16. B o t s t e i n  D.,  W h i t e  R.L.,  S c o l n i c k  M. e.a. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphism. Am. J. Hum. Genet., 1980, 32: 314-331.

ANALYSIS OF GENETIC VARIABILITY AND PHYLOGENETIC RELATIONS IN POPULATIONS OF TUVINIAN SHORT-FAT-TAILED SHEEP WITH ISSR-MARKERS USAGE

Yu.A. Stolpovskii1, L.V. Shimiit2, N.V. Kol1, A.N. Evsyukov1, M.N. Rusina1, O.I. Churgui-ool3, G.E. Sulimova1

The populations of sheep of the Tuvinian short-fat-tailed breed were investigated with ISSR-PCR (inter simple sequence repeats) markers usage in 18 genofond and livestock farms of Tuva Republik. The genetic parameters of variability and phylogenetic relations between intrabreed groups were determined. The populations were revealed, where typical animals or most closely resemble the averaged genofond of Tuvinian sheeps are concentrated. The data obtained may be used in breeding and conservation of Tuvinian sheeps in situ.

Key words: Inter Simple Sequence Repeats, ISSR profiling of genetic variability, genetic structure, diversity, monitoring, gene pool, conservation in situ.

1Институт общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН,
119991 г. Москва, ул. Губкина, 3,
e-mail: stolpovsky@vigg.ru;
2ФГОУ ВПО Тывинский государственный
университет, кафедра зоотехнии,

667000 Республика Тыва, г. Кызыл, ул. Ленина, 36;
3Управление сельского хозяйства и
природопользования Республики Тыва
,
667010 Республика Тыва, г. Кызыл, ул. Калинина, 19

Поступила в редакцию
21 сентября 2009 года

 

Оформление электронного оттиска

назад в начало