УДК 633.23:631.52:581.143.6

ПОЛУЧЕНИЕ РАСТЕНИЙ ПОЛЕВИЦЫ ПОБЕГОНОСНОЙ С КОМПЛЕКСНОЙ УСТОЙЧИВОСТЬЮ К ТЯЖЕЛЫМ МЕТАЛЛАМ И ЗАСОЛЕНИЮ МЕТОДАМИ КЛЕТОЧНОЙ СЕЛЕКЦИИ

Е.А. ГЛАДКОВ1,2

Разрабатывали биотехнологические методы получения клеточных линий и регенерантов полевицы побегоносной (Agrostis stolonifera), устойчивых к комплексному воздействию тяжелых металлов и засоления. Для получения растений, обладающих устойчивостью к меди и хлориду натрия, применяли ступенчатую схему селекции. Растения, устойчивые к ионам меди и цинка, получали методом прямой клеточной селекции.

Ключевые слова: клеточная селекция, толерантность, тяжелые металлы, засоление.

 

Многие кормовые культуры очень чувствительны к засолению и тяжелым металлам, поэтому важной задачей является создание толерантных растений. В антропогенных экосистемах растения подвергаются комплексному загрязнению от многих источников (1-4). Тяжелые металлы поступают в них из воздуха, при внекорневой подкормке посредством опрыскивания листьев, в результате протравливания семян, использования пестицидов и т.д. Одна треть почв, используемых под орошаемое земледелие, засолена.

С помощью клеточной селекции удалось создать формы, устойчивые к определенному экологическому фактору — засухе, засолению, тяжелым металлам (5-8).

Целью настоящей работы было получение растений, обладающих комплексной устойчивостью к тяжелым металлам и засолению, с помощью методов клеточной селекции.

Методика. Объектом исследования служила полевица побегоносная (Agrostis stolonifera),которая относится к ценным кормовым злакам и хорошо поедается животными.

Семена проращивали в чашках Петри на фильтровальной бумаге, смоченной водой (контроль), растворами сульфата меди (концентрации в пересчете на чистый металл 50; 75; 100 и 150 мг/л), сульфата цинка (150 мг/л), хлорида натрия (0,3 и 0,6 %). Начиная с 4-х сут, определяли всхожесть семян и степень развития проростка.

Каллус получали на агаризованной среде Мурасиге-Скуга (МС) с добавлением 3 мг/л 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты.

Для выделения устойчивых к меди и хлориду натрия растений применяли ступенчатую схему селекции. Были использованы различные концентрации токсикантов в комплексе (меди — 50; 75 и более 100 мг/л, хлорида натрия — 0,3; 0,5 и более 0,6 %).

На первом этапе каллус высаживали на среду МС, содержащую 50 мг/л Cu и 0,3 % NaCl. На стадии регенерации и укоренения концентрацию токсикантов увеличивали соответственно до 75 мг/л и 0,5 %. Выжившие растения-регенеранты первоначально выращивали в почве без добавления токсикантов. Затем их подстригали до высоты 16 см, а в почву в виде водных растворов вносили соль меди и хлорид натрия до конечного содержания (в расчете на сухую массу почвы) соответственно 75 мг/кг и 0,5 % или 150 мг/кг и 0,7 %. Оценивали прирост регенерантов в сравнении с обычными растениями. Контролем служили растения, высаженные на субстрат, не содержащий токсикантов.

В экспериментах по созданию растений, устойчивых к меди и цинку, применяли прямую схему клеточной селекции (9) — культивирование каллусных культур в течение двух пассажей на селективной среде МС с последующей регенерацией и укоренением. На каждом этапе в среду добавляли соли меди и цинка (соответственно 75 и 150 мг/л). Для оценки токсичности меди и цинка первичный каллус высаживали на питательную среду МС с различным содержанием токсикантов (медь — 75, 150 мг/л; цинк — 100, 200, 300, 450 мг/л). Через месяц оценивали устойчивость каллусных культур к ионам тяжелых металлов по изменению сырой массы.  

В каждом варианте анализировали по 100-200 семян и 50-100 каллусов, опыты проводили в 3-кратной повторности.

Статистическую обработку осуществляли в программе Microsoft XL 2003. Ошибку рассчитывали с помощью критерия Стьюдента.

Результаты. Ионы меди в изученных концентрациях оказывали сильное ингибирующее действие на всхожесть семян и рост побегов полевицы.

 1. Всхожесть семян и рост побегов полевицы побегоносной (по отношению к контролю, %) при  разных концентрациях ионов меди и хлорида натрия в среде (4-е сут)

Концентрация

Всхожесть

Рост побегов

Cu, мг/л

NaCl, %

50

0

73,0±4,5

42,0±3,0

100

0

12,0±1,0

29,2±2,5

150

0

4,2±0,2

18,4±0,5

50

0,3

41,4±1,5

42,0±3,5

100

0,3

10,5±0,5

30,0±2,1

100

0,6

0

0

150

0,3

0

0

150

0,6

0

0

Фитотоксичность меди особенно сильно проявлялась в период прорастания семян (табл. 1), однако на 10-е сут всхожесть значительно увеличивалась. При концентрации меди 50 и 100 мг/л она составляла соответственно 100 и 60 %, рост побегов через 1 нед также существенно усилился. Мы также отмечали фитотоксичность меди при концентрации 30 мг/л в водном растворе и содержании в почве 30 мг/кг (что значительно ниже предельно допустимого значения) при подавление роста побегов, не превышающем 25 % от контроля (4).

 

 

 

 

2. Рост каллусных тканей полевицы побегоносной при разных концентрациях ионов меди и хлорида натрия в среде Мурасиге-Скуга

Концентрация

Число  каллусов, шт.

Cu, мг/л

NaCl, %

общее

погибших

50

0,3

300

100

75

0,3

140

50

75

0,5

140

80

 При комплексном воздействии хлорида натрия и меди токсическое действие последней усиливалось, особенно в впервые сутки после прорастания (см. табл. 1). При добавлении 0,3 % хлорида натрия и 50 мг/л меди всхожесть семян была ниже. На 10-е сут токсичность хлорида натрия в сочетании с ионами меди существенно уменьшалась. Семена прорастали при концентрациях меди и хлорида натрия соответственно 100 мг/л и 0,6 %, а также 150 мг/л и 0,3 %.

 3. Регенерационная способность каллусных тканей полевицы побегоносной при разных концентрациях ионов меди и хлорида натрия в среде Мурасиге-Скуга

Концентрация

Число  каллусов, шт.

Cu, мг/л

NaCl, %

общее

способных к регенерации

75

0,3

50

10

75

0,5

100

14

100

0,6

50

0

 

 

 

 

 

 

 

 

Совместное действие цинка и меди усиливало токсический эффект последней (табл. 4). Возможно, цинк стимулирует повышенное поступление меди в растения. Однако указанные металлы конкурируют за точки воздействия на клеточные мембраны, поскольку для проникновения в клетку они должны быть связаны с металлотионеиновыми белками (10).

4. Всхожесть семян и рост побегов полевицы побегоносной (по отношению к контролю, %) при разных концентрациях ионов меди и цинка (через 10 сут после посева семян)

Концентрация, мл/л

Всхожесть

Рост  растений

Cu

Zn

75

150

70,0±2,9

56,0±3,8

75

0

82,0±4,1

65,0±4,4

100

150

60,0±4,9

33,0±3,3

100

0

60,0±5,6

56,0±4,0

Влияние этих металлов на культуру клеток было более существенным, чем на семена растений. Для растений сублетальная концентрация меди составляла 100 мг/л, цинка — 150 мг/л (см. табл. 4). Для каллусов токсический эффект наблюдали при концентрации токсикантов соответственно 100 и 200 мг/л, но регенерационная способность была низкой уже при 75 и 150 мг/л. При концентрации меди и цинка соответственно 150 и 450 мг/л каллус приобретал темно-коричневую окраску, большая часть инокулюмов утрачивала способность к регенерации. В результате прямой клеточной селекции отобрали 10 растений, из которых четыре в процессе дальнейшей проверки показали повышенную устойчивость к ионам меди и цинка.

Итак, из каллусной ткани полевицы побегоносной нами были получены растения, обладающие комплексной устойчивостью к меди и хлориду натрия, а также к меди и цинку. Показано, что в случае высокой фитотоксичности и усиления неблагоприятного воздействия следует использовать ступенчатую схему селекции, а прямая селекция предпочтительнее при меньшей фитотоксичности. Разработанные биотехнологии можно рекомендовать для получения других кормовых трав, устойчивых к тяжелым металлам и засолению.

Л И Т Е Р А Т У Р А

1. А л е к с е е н к о  В. Цинк и кадмий в окружающей среде. М., 1992.
2. Растения в экстремальных условиях минерального питания /Под ред. М.Я. Школьника, Н.В. Алексеевой-Поповой. Л. 1983.
3. Д м и т р и е в  В.В.,  Ф р у м и н  Г.Т. Экологическое нормирование и устойчивость природных экосистем. СПб, 2004.
4. Г л а д к о в  Е.А. Влияние комплексного взаимодействия тяжелых металлов на растения мегаполисов. Экология, 2007, 1: 71-74.
5. Г л а д к о в  Е.А.,  Г л а д к о в а  О.В. Оценка комплексной фитотоксичности тяжелых металлов и получение растений, обладающих комплексной устойчивостью. Биотехнология, 2007, 1: 81-86.
6. Г л а д к о в  Е.А. Биотехнологические методы получения растений полевицы побегоносной с устойчивостью к кадмию и свинцу. С.-х. биол., 2008, 3: 83-87.
7. Г л а д к о в  Е.А.,  Д о л г и х  Ю.И.,  Г л а д к о в а  О.В. и др. Клеточная селекция газонных трав, толерантных к ионам меди. Биотехнология, 2006, 5: 53-58.
8. G i l i s s e n  L.J.W.,  S t a v e r e n  M.J. Zinc-resistant cell lines of Haplopapput gracilis. J. Рlant Physiol., 1986, 125: 95-103.
9. Г л а д к о в  Е.А.,  Г л а д к о в а  О.Н.,  Г л у ш е ц к а я  Л.С. Биотехнологический способ получения устойчивых растений к солям свинца. В сб.: Науч. тр. МГУИЭ. М., 2006: 91-96.
10. Б у т о в с к и й  Р.О. Тяжелые металлы как техногенные химические загрязнители и их токсичность для почвенных беспозвоночных животных. Агрохимия, 2005, 4: 73-91.

 

BIOTECHNOLOGICAL METHODS FOR ISOLATION THE PLANTS POSSESSING COMPLEX STABILITY TO HEAVY METALS AND SALINIZATION

E.A. Gladkov1,2

The biotechnological methods were development for reception of cellular lines and regen-erants of Agrostis stolonifera tolerant to complex influence of heavy metals and salinization. The plants resistant to cooper and sodium chloride were isolated by means of stepped breeding scheme. The plants resistant to cooper and zinc were isolated by the method of direct cellular selection.

Key words: cell selection, tolerant, heavy metals, salinity.

1Институт физиологии растений РАН, 127276 г. Moсква, ул. Ботаническая, 35,
2ФГОУ ВПО Московский государственный
университет инженерной экологии,

105066 г. Москва, ул. Старая Басманная, 21/4,
e-mail: gsc@ippras.ru

Поступила в редакцию
17 июня 2009 года

 

Оформление электронного оттиска

назад в начало