Сельскохозяйственная биология, 2009, № 6, с. 3-10.

УДК 636.018:591.16:591.463.1:59.086

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ РАЗДЕЛЕННОГО ПО ПОЛУ СЕМЕНИ В ПРАКТИКЕ ЖИВОТНОВОДСТВА (обзор)

А.С. ЕРОХИН, М.И. ДУНИН

Обсуждается современная технология разделения сперматозоидов по полу с использованием высокоскоростной проточной цитометрии. Обобщены результаты исследований по искусственному осеменению крупного рогатого скота и других видов сельскохозяйственных животных разделенной спермой, а также по пересадке им эмбрионов, полученных с помощью разделенного семени in vitro.

Ключевые слова: проточная цитометрия, разделенная по полу сперма, искусственное осеменение, оплодотворяемость, телки, овцы, свиньи, лошади.

Регуляция пола у сельскохозяйственных животных представляет значительный практический интерес, поскольку способствует ускорению селекционно-племенной работы. Ранее изучалась возможность разделения сперматозоидов, содержащих Х- или Y-хромосому, осаждением, центрифугированием в градиенте плотности, электрофорезом, обработкой специфическими антителами и т.д. (1-3). Однако на практике не было получено убедительных доказательств эффективности этих приемов.

В последние годы во многих странах для сортировки спермы по полу используют метод проточной цитометрии, основанный на неодинаковом содержании ДНК в сперматозоидах (4-6). В 1979 году было установлено, что в Х-хромосоме млекопитающих оно выше, чем в Y-хромосоме (7), в частности у быков — на 3,8, у хряков — на 3,6, у баранов — на 4,2, у жеребцов — на 3,7 % (4, 8). При разделении сперматозоидов было предложено использовать специальный краситель для ДНК и аналитическую проточно-цитометрическую систему, которую дополнили приспособлением для направленной ориентации клеток в потоке, что способствует более четкому выявлению различий в светоизлучении (9).

На основании результатов исследований, проведенных американскими учеными, была усовершенствована обычная аналитическая проточно-цитометрическая система и разработана Белтсвилская технология разделения спермы, которая состоит из нескольких операций (10, 11). Разбавленную сперму, к которой добавлен флуоресцентный витальный краситель Hoechst 33342, инкубируют при 35 °С в течение 1 ч для лучшего проникновения красителя через мембранные структуры. Затем сперма под давлением поступает в высокоскоростной проточный цитометр, где создаются условия для ориентации головки сперматозоидов при пересечении лазерного луча. Лазерное излучение индуцирует флуоресценцию красителя, которая улавливается мощным световым детектором и анализируется компьютером. После идентификации сперматозоидов, несущих Х- или Y-хромосому, специальный вибратор образует в растворе микрокапли, куда попадает по одной половой клетке. В зависимости от величины светоизлучения, обусловленной содержанием в такой клетке Х- или Y-хромосомы, каждая микрокапля приобретает положительный или отрицательный заряд. Микрокапли с поврежденными или неидентифицированными сперматозоидами заряда не несут. В современных установках формируется 70-80 тыс. микрокапель в секунду (12). На следующем этапе образовавшиеся положительно, отрицательно или нейтрально заряженные частицы разделяются, проходя через электростатическое поле, и поступают в разные емкости. Затем сперматозоиды концентрируют центрифугированием и разбавляют специальной средой (13-15).

Разработанная технология предусматривала использование стандартной системы с рабочим давлением в пределах 0,84 кг/см2. При этом скорость разделения составляла 350 тыс. сперматозоидов в час (10). Позднее, когда описанную технологию усовершенствовали, в том числе за счет повышения давления в системе до 4,22 кг/см2, стало возможным сортировать до 11 млн сперматозоидов в час и получать образцы, содержащие 90 % клеток с Х- или Y-хромосомой (8).

Были проведены углубленные исследования по улучшению ориентации головки сперматозоидов относительно лазерного луча и оптического детектора (5, 14, 16). Вследствие плоской формы головки лишь 30 % клеток имеют правильную пространственную ориентацию при прохождении через лазерный луч, причем только половина из них содержит Х- или Y- хромосому. Из общего объема эякулята удается получить не более 15 % сперматозоидов с определенной половой хромосомой, что обусловливает высокую стоимость разделенного по полу семени. В настоящее время разделенная сперма быков может быть экономически выгодной производителю только при условии, что в дозе содержится пониженное число сперматозоидов (около 2 млн подвижных клеток по сравнению с 10-15 млн сперматозоидов при обычном осеменении крупного рогатого скота криоконсервированной спермой).

В процессе разделения с помощью высокоскоростной проточной  цитометрии сперматозоиды подвергаются действию неблагоприятных факторов (окрашивание, высокая степень разбавления семени, лазерное излучение, давление, электромагнитное поле, центрифугирование) (17-19), поэтому важна разработка условий, обеспечивающих сохранение биологической полноценности половых клеток. В частности, для предохранения их от агглютинации в состав буферного раствора вводят 0,1 % бычьего сывороточного альбумина, а после разделения помещают в TEST-желточный буфер (20). Показано, что лучшая подвижность сперматозоидов после оттаивания сохраняется при центрифугировании половых клеток сразу после сортировки и добавлении глицерина в состав охлажденного до 4 °С семени незадолго до замораживания (21). Для проверки чистоты разделения образцов спермы на Х- и Y-фракции применяют полимеразную цепную реакцию (22), а также метод флуоресцентной гибридизации (23).

В 1988 году установлено, что разделенные с помощью проточной цитометрии сперматозоиды способны к образованию пронуклеуса при введении в ооциты хомячков (24). В том же году английскими исследователями были проведены первые опыты по использованию разделенной спермы для искусственного осеменения телок и крольчих (25). Две группы телок осеменяли с помощью цервикального введения фракции сперматозоидов с Х- или Y-хромосомой (в дозе содержалось 5 млн клеток). Оплодотворяемость животных оказалась очень низкой, и телки в основном абортировали между 4-м и 5-м мес беременности. Изучение половых органов у абортированных плодов показало, что в варианте с осеменением Х-фракцией 8 из 11 плодов были самками, при использовании Y-фракции 12 из 20 — самцами. Низкие результаты оплодотворяемости отмечали и у крольчих, однако в этом случае удалось получить живых крольчат, которые нормально развивались и в дальнейшем принесли здоровое потомство.

В опытах американских ученых по осеменению крольчих сперму самкам вводили внутриматочно. В группе, где использовали фракцию сперматозоидов с Х-хромосомой, получили 94 % самок, с Y-хромосомой — 81 % самцов (10). Внутритрубное введение свиньям разделенного по полу семени хряков позволило получить в потомстве 68 % самцов и 74 % самок при оплодотворении соответственно Y- и Х-фракцией (20).

Позднее были проведены успешные эксперименты по оплодотворению яйцеклеток крупного рогатого скота разделенными сперматозоидами in vitro (26). С помощью проточной цитометрии выделяли фракции спермы, содержащие до 79 % половых клеток с Х- и до 70 % — с Y-хромосомой. Телкам пересаживали эмбрионы предполагаемого пола, в результате чего в первой группе родилось 3 телочки, во второй — 3 бычка. В последующих опытах удалось получить до 90 % особей мужского пола (27).

На коровах также изучали эффективность пересадки эмбрионов, полученных in vitro с помощью разделенного семени (28). Приживляемость эмбрионов у коров со спонтанным эструсом составила 16,3, с синхронизированным — 20,0, у телок — 34,2 %. Из 40 родившихся особей 37 были телочками.

В более поздних исследованиях оценили эффективность пересадок коровам заморожено-оттаянных эмбрионов, полученных in vitro с использованием фракции Х-сперматозоидов (29). Приживляемость таких эмбрионов в опытной группе составила 40,9 %, в контрольной, где использовались обычные эмбрионы, — 41,9 %. Всего родилось 458 телят, из которых 96,8 % были самками.

В связи с тем, что скорость разделения сперматозоидов при проточной цитометрии не позволяет получать достаточно семени для обычного искусственного оплодотворения крупного рогатого скота, изучалась возможность введения половых клеток непосредственно в рога матки (30, 31). Дозу неразделенной спермы, содержащую 100-500 тыс. сперматозоидов, вводили в рог матки телок с помощью инструментов для эмбриопересадки. В некоторых группах оплодотворяемость оказалась довольно высокой. Затем для осеменения использовали разделенную фракцию незамороженной спермы со 100-200 тыс. сперматозоидов в дозе. Из 17 полученных телят 14 соответствовали предполагаемому полу (31). В другом опыте 35 телкам в рога матки вводили по 300 тыс. незамороженных разделенных сперматозоидов, содержащих преимущественно Х-хромосому, а контрольных животных осеменяли такой же дозой неразделенной спермы. Оплодотворяемость в опытной группе составила 42, в контроле — 54 %. В опытной группе получили 80 % телочек (32). В экспериментах по осеменению пониженной дозой заморожено-оттаянных разделенных по полу сперматозоидов (1 млн клеток) оплодотворяемость составила 52 %. Эти показатели сопоставимы с результатами обычного искусственного осеменения коров криоконсервированной спермой, содержащей в дозе 15-20 млн половых клеток (33). При внутриматочном осеменении телок разделенной по полу  криоконсервированной спермой (1,0; 1,5 или 3,0 млн сперматозоидов в дозе) также удалось получить высокие показатели оплодотворяемости (43-54 %) (34).

В полевых испытаниях швейцарских ученых телкам и коровам из опытных групп внутриматочно вводили по 2 млн подвижных заморожено-оттаянных сперматозоидов с Х-хромосомой. В контрольных группах животных осеменяли аналогичной дозой неразделенных половых клеток. В опыте и контроле доля отелившихся телок равнялась соответственно 29,6 и 55,6 %, коров — 21,9 и 23,4 %. При этом в опытных группах родилось 85,3 % самок, в контрольных — 58,6 % (35).

Эстонские исследователи выясняли эффективность осеменения телок разделенной спермой при введении 2,2 млн заморожено-оттаянных сперматозоидов в маточно-трубное сочленение, рога или тело матки (36). Оплодотворяемость во всех вариантах оказалась практически одинаковой и составила соответственно 37,7; 42,2 и 39,6 %.

В Финляндии проводились испытания по осеменению коров голштинской породы криоконсервированной разделенной спермой (37). В период спонтанной охоты 157 животным из опытной группы вводили внутриматочно 2 млн разделенных сперматозоидов, а 149 из контрольной — 15 млн неразделенных. В опытной группе отелилось 20 % коров и родилось 82 % телочек. В контроле эти показатели составили соответственно 45 и 49 %. Полученные результаты свидетельствуют о значительном снижении оплодотворяемости при использовании для осеменения пониженного числа сперматозоидов в дозе разделенной спермы.

В экспериментах итальянских ученых при введении телкам внутриматочно криоконсервированной разделенной спермы, полученной от четырех быков (1 или 2 млн сперматозоидов), оплодотворяемость составила 51 %, в потомстве было 87 % самок. Кроме того, проявились достоверные различия в оплодотворяющей способности семени у разных быков. По мнению авторов, необходимо проводить тщательный отбор быков перед их использованием для получения разделенной по полу спермы (38).

В полевых испытаниях, проведенных в США на 211 фермах, оплодотворяемость телок голштинской породы сперматозоидами из фракции, содержащей Х-хромосому, достигала 47 %, телок джерсейской породы — 53 %. В потомстве получено 89 % самок (39). Установлен факт более высокой доли мертворождений среди телят мужского пола при осеменении сперматозоидами с Х-хромосомой.

В специальных исследованиях изучали влияние процесса разделения спермы с помощью скоростной проточной цитометрии на состояние здоровья и развитие телят, а также на генетические изменения у потомства (40). Используя данные по 1169 и 793 телятам, полученным при оплодотворении коров соответственно разделенной и обычной спермой, анализировали продолжительность беременности, легкость отела, частоту абортов и мертворождений, живую массу телят при рождении и отъеме, смертность телят в неонатальный и более поздний период, а также различные анатомические аномалии. Достоверных различий по изучаемым показателям между двумя группами животных не установили. При использовании неразделенной спермы получили 49,2 % бычков, Х-содержащей фракции сперматозоидов — 87,8 % самок, Y-содержащей фракции — 92,1 % самцов. Разделение спермы не оказывало влияния на раннюю эмбриональную смертность у телок (34).

Применение высокоскоростной проточной цитометрии для разделения сперматозоидов быков не нарушает структуру ДНК в клетках (41). За рубежом коммерческое использование разделенной по полу спермы началось в 2000 году, и к настоящему времени этим способом в мире получено более 2 млн телят (42). В основном разделенную сперму быков применяют для осеменения телок. В среднем в дозе содержится не менее 2 млн подвижных сперматозоидов. Предпринимаются попытки улучшить биологическую полноценность разделенной спермы в процессе ее криоконсервации. В частности, изучено защитное влияние антиоксидантов пирувата натрия и каталазы, добавление которых в состав синтетической среды улучшало подвижность и выживаемость заморожено-оттаянных сперматозоидов (43). Совместное введение в состав среды для разделения сперматозоидов бычьего сывороточного альбумина и антиоксидантов значительно повышало выживаемость и оплодотворяющую способность незамороженных половых клеток (44).

Основная трудность при применении разделенной спермы в свиноводстве состоит в том, что число сперматозоидов в дозе должно быть больше, чем при осеменении крупного рогатого скота. Первых поросят от разделенного семени получили после лапароскопического введения спермы непосредственно в яйцеводы свиней (20). Позднее яйцеклетки оплодотворяли in vitro c использованием фракции Х-сперматозоидов (45). Все потомки, родившиеся у свинок после пересадки им таких эмбрионов, оказались самками. Также удалось получить потомство мужского пола при внутрицитоплазматическом введении разделенных незамороженных сперматозоидов хряка в яйцеклетки и их дальнейшей активации in vitro (46).

С целью уменьшения числа сперматозоидов в дозе для осеменения свиней разработана методика глубокоматочного введения спермы через цервикальный канал с помощью гибкого катетера (47, 48). Оказалось, что для нормальной оплодотворяемости свиней достаточно ввести в верхушку рога матки 50-70 млн разделенных сперматозоидов (49, 50). Кроме того, предлагается вводить семя непосредственно в яйцеводы с помощью лапароскопа (51, 52). Использование этой методики позволило достичь высокой оплодотворяемости при дозе 0,3; 0,5 и 1,0 млн сперматозоидов. Анализ генетических изменений в лимфоцитах поросят, полученных от разделенного семени, не выявил мутагенного воздействия высокоскоростной проточной цитометрии на половые клетки (53). При 2-кратном осеменении свиней разделенной заморожено-оттаянной спермой в дозе 160 млн сперматозоидов отмечено значительное увеличение эмбриональной смертности по сравнению с показателем в контрольной группе, осемененной неразделенной спермой (54).

В овцеводстве и коневодстве также проводятся исследования эффективности применения разделенной по полу спермы. Австралийские ученые впервые получили потомство от разделенной спермы баранов в 1996 году (55). Овцам пересаживали эмбрионы, полученные in vitro с помощью внутриплазматического введения в яйцеклетки одиночных разделенных сперматозоидов. В 1997 году были выполнены успешные эксперименты по искусственному осеменению овец разделенной спермой с использованием лапароскопа (56). Эффективность лапароскопического осеменения овец заморожено-оттаянной разделенной спермой изучалась в специальных опытах (57). Овцам из опытных групп внутриматочно вводили 1, 5 и 15 млн заморожено-оттаянных разделенных сперматозоидов, контрольным животным — 50 млн неразделенных. Оплодотворяемость в опыте составила соответственно 61,5; 66,1 и 66,7 %; в контроле — 63,2 %.

У кобыл при инъекции разделенной незамороженной спермы в верхушку рога матки получили 87 % потомков желаемого пола (58). По мнению ряда ученых, гистероскопическое введение половых клеток в верхушку рога матки — более перспективный способ осеменения (59, 60). Оплодотворяемость удавалось повысить, если 20 млн сперматозоидов помещали в маточно-трубное сочленение (61). Этим способом также получали потомство, применяя криоконсервированную разделенную сперму жеребцов (42).

Таким образом, технология разделения сперматозоидов по полу с использованием высокоскоростной проточной цитометрии представляет собой эффективный способ регуляции пола и в настоящее время находит применение в практике разведения не только крупного рогатого скота, но и других видов сельскохозяйственных животных. Дальнейшее совершенствование этой технологии позволит улучшить результативность разделения сперматозоидов и повысить эффективность искусственного осеменения.

Л И Т Е Р А Т У Р А

1. М и л о в а н о в  В.К.,  Е р о х и н  А.С. Направления и перспективы искусственного регулирования соотношения полов в потомстве (обзор). Сельское х-во за рубежом, 1980, 1: 43-47.
2. Е р о х и н  А.С. Регулирование овуляции и соотношения полов у млекопитающих. Канд. дис. Дубровицы, 1982.
3. J o e r g  H.,  A s a i  M.,  G r a p h o d a t s k a y a  D. e.a. Validating bovine sexed semen samples using quantitative PCR. J. Anim. Breed. Genet., 2004, 121: 209-215.
4. G a r n e r  D.L.,  G l e d h i l l  B.L.,  P i n k e l  D. e.a. Quantification of the X- and Y-chromosome-bearing sperm of domestic animals by flow cytometry. Biol. Reprod., 1983, 28: 312-321.
5. W e l c h  G.R.,  J o h n s o n  L.A. Sex preselection: laboratory validation of the sperm sex ratio of flow sorted X- and Y- sperm by sort reanalysis for DNA. Theriogenology, 1999, 52: 1343-1352.
6. S e i d e l  G.E. Jr.,  G a r n e r  D.L. Current status of sexing mammalian spermatozoa. Reproduction, 2002, 124: 733-743.
7. M o r u z z i  J.F. Selecting a mammalian species for the separation of X- and Y-chromo-some-bearing spermatozoa. J. Reprod. Fertil., 1979, 57: 319-323.
8. J o h n s o n  L.A.,  W e l c h  G.R. Sex preselection: high-speed flow cytometric sorting of X- and Y-sperm for maximum efficiency. Theriogenology, 1999, 52: 1323-1341.
9. P i n k e l  D.,  G l e d h i l l  B.L.,  V a n  D i l l a  M.A. e.a. High resolution DNA measurement of mammalian sperm. Cytometry, 1982, 3: 1-9.
10. J o h n s o n  L.A.,  F l o o k  J.P.,  H a w k  H.W. Sex preselection in rabbits: live birth from X- and Y- sperm separated by DNA and cell sorting. Biol. Reprod., 1989, 41: 199-203.
11. J o h n s o n  L.A.,  W e l c h  G.R.,  R e n s  W. The Beltswille sperm sexing technology: high-speed sorting gives improved sperm output for IVF and A.I. J. Anim. Sci., 1999, 77(2): 213-220.
12. S e i d e l  G.E. Jr. Overview of sexing sperm. Theriogenology, 2007, 68: 443-446.
13. J o h n s o n  L.A.,  F l o o k  J.P.,  L o o k  M.V. Flow cytometry of X- and Y- chromosome-bearing sperm for DNA using an improved preparation method and staining with Hoechst 33342. Gamete Research, 1987, 17: 203-212.
14. R e n s  W.,  W e l c h  G.P.,  J o h n s o n  L.A. A novel nozzle for more efficient sperm orientation to improve sorting efficiency of X- and Y-chromosome-bearing sperm. Cytometry, 1998, 33: 476-481.
15. S e i d e l  G.E. Jr. Sexing mammalian sperm-intertwining of commerce, technology, and biology. Anim. Reprod. Sci., 2003, 79: 145-156.
16. J o h n s o n  L.A.,  F l o o k  J.P.,  L o o k  M.V. e.a. Flow sorting of X- and Y-chromosome bearing spermatozoa into two populations. Gamete Research, 1987, 16: 1-9.
17. C r a n  D.G. Semen sexing, practice and application. Proc. 3d Conf. of Europ. Society for domestic animal reprod. Anger, France, 1999: 18-19.  
18. M a x w e l l  W.M.,  J o h n s o n  L.A. Physiology of spermatozoa at high dilution rates: the influence of seminal plasma. Theriogenology, 1999, 52: 1353-1362.
19. K l i n c  P.,  R a t h  D. Application of flow cytometrically sexed spermatozoa in different farm animal spicies (a review). Arch. Tierz., Dummerstorf, 2006, 49: 41-54.
20. J o h n s o n  L.A. Sex preselection in swine: altered sex ratios in offspring following surgical insemination of flow sorted X- and Y-bearing sperm. Reprod. Domest. Anim., 1991, 26: 309-314.
21. S i e g  B.,  K l i n c  P.,  F r e s e  D. e.a. Improvement of sexed bull semen processing for cryopreservation. Reprod. Domest. Anim., 2003, 38: 329-330.
22. W e l c h  G.R.,  W a l d b i e s e r  G.C.,  W a l l  R.J. e.a. Flow cytometric sperm sorting and PCR to confirm separation of X- and Y-chromosome-bearing bovine sperm. Anim. Biotechnol., 1997, 6: 131-139.
23. K a w a r a s a k i  T.,  W e l c h  G.R.,  L o n g  C.R. e.a. Verification of flow cytometrically sorted X-and Y-bearing porcine spermatozoa and reanalysis of spermatozoa for DNA content using the fluorescence in situ hybridization (FISH) technique. Theriogenology, 1998, 50: 625-635.
24. J o h n s o n  L.A.,  C l a r k e  R.N. Flow sorting of X- and Y-chromosome-bearing mammalian sperm: activation and pronuclear development of sorted bull, boar, and ram sperm microinjected into hamster oocytes. Gamete Res., 1988, 21: 335-343.
25. M o r r e l l  J.M.,  K e e l e r  K.D.,  N o a k e s  D. e.a. Sexing of sperm by flow cytometry.  Vet. Record, 1988, 122: 322-324.
26. C r a n  D.G.,  J o h n s o n  L.A.,  M i l l e r  N.G. e.a. Production of bovine calves following separation of X- and Y-chromosome-bearing sperm and in vitro fertilization. Vet. Record,  1993, 132: 40-41.
27. C r a n  D.G.,  J o h n s o n  L.A.,  P o l g e  C. Sex preselection in cattle: a field trial. Vet. Record, 1995, 136: 495-496.
28. W i l s o n  R.D.,  W e i g e l  K.A.,  F r i c k e  P.M. e.a. In vitro production of Holstein embryos using sex-sorted sperm and oocytes from selected cull cows. J. Dairy Sci., 2005, 88: 776-782.
29. X u  J.,  G u o  Z.,  S u  L. e.a. Developmental potential of vitrified Holstein cattle embryos fertilized in vitro with sex-sorted sperm. J. Dairy Sci., 2006, 89: 2510-2518.
30. S e i d e l  G.E. Jr.,  J o h n s o n  L.A.,  A l l e n  C.A. e.a. Artificial insemination with X- and Y-bearing bovine sperm. Theriogenology, 1996, 45: 309.
31. S e i d e l  G.E. Jr.,  A l l e n  C.H.,  J o h n s o n  L.A. e.a. Uterine horn insemination of heifers with very low numbers of non-frozen and sexed spermatozoa. Theriogenology, 1997, 48: 1255-1264.
32. S e i d e l  G.E. Jr.,  H e r r i c k h o f f  L.A.,  S h h e n k  J.L. e.a. Artificial insemination of heifers with cooled unfrozen, sexed semen. Theriogenology, 1998, 49: 365.
33. S c h e n k  J.L.,  S u h  T.K.,  C r a n  D.G. e.a. Cryopreservation of flow-sorted bovine spermatozoa. Theriogenology, 1999, 52: 1375-1391.
34. S e i d e l  G.E. Jr.,  S c h e n k  J.L.,  H e r i c k h o f f  L.A. e.a. Insemination of heifers with sexed sperm. Theriogenology, 1999, 52: 1407-1420.
35. B o d m e r  M.,  J a n e t t  F.,  D e n  D a a s  N. e.a. Fertility after low dose insemination of sexed sperm in heifers and cows under field conditions. Reprod. Domest. Anim., 2004, 39: 254.
36. K u r y k i n  J.,  J a a k m a  U.,  J a l a k a s  M. e.a. Deposition of sexed semen at different sites in the uterus at a fixed time and pregnancy rates in heifers. Reprod. Domest. Anim., 2006, 41: 312.
37. A n d e r s s e n  M.,  T a p o n e n  J.,  K o m m e r i  M. e.a. Pregnancy rates in lactating Holstein-Friesian cows after artificial insemination with sexed sperm. Reprod. Domest. Anim., 2006, 41: 95-97.
38. C e r c h i a r o  I.,  C a s s a n d r o  M.,  D a l  Z o t t o  R. e.a. A field study on fertility and purity of sex-sorted cattle sperm. J. Dairy Sci., 2007, 90: 2538-2542.  
39. D e  J a r n e t t e  J.M.,  N e b e l  R.L.,  M a r s h a l l  C.E. Evaluating the success of sex-sorted semen in US dairy herds from on farm records. Theriogenology, 2009, 71: 49-58.
40. T u b m a n  L.M.,  B r i n k  Z.,  S u h  T.K. e.a. Characteristics of calves produced with sperm sexed by flow cytometry cell sorting. J. Anim. Sci., 2004, 82: 1029-1036.
41. B o e - H a n s e n  G.B.,  M o r r i s  I.D.,  A n n e t t e  B. e.a. DNA integrity in sexed bull sperm assessed by neutral Comet assay and sperm chromatin structure assay. Theriogenology, 2005, 63: 1789-1802.
42. R a t h  D.,  J o h n s o n  L. Application and commercialization of flow cytometrically sex-sorted semen. Reprod. Domest. Anim., 2008, 43: 338-346.
43. K l i n c  P.,  R a t h  D. Reduction of oxidative stress in bovine spermatozoa during flow cytometric sorting. Reprod. Domest. Anim., 2007, 42: 63-67.
44. K l i n c  P.,  F r e s e  D.,  O s m e r s  H. e.a. Insemination with sex-sorted fresh bovine spermatozoa processed in the presence of antioxidative substances. Reprod. Domest. Anim., 2007, 42: 58-62.
45. R a t h  D.,  J o h n s o n  L.A.,  W e l c h  G.R. In vitro culture of porcine embryos: development to blastocysts after in vitro fertilization (IVF) with flow cytometrically sorted and unsorted semen. Theriogenology, 1993, 39: 293.
46. P r o b s t  S.,  R a t h  D. Production of piglets using intracytoplasmic sperm injection (ICSI) with flow cytometrically sorted boar semen and artificially activated oocytes. Theriogenology, 2003, 59: 961-973.
47. R a t h  D. Low dose insemination in the sow (а review). Reprod. Domest. Anim., 2002, 37: 1291-1304.
48. M a r t i n e z  E.A.,  V a z q u e z  J.M.,  R o c a  J. e.a. Minimum number of spermatozoa required for normal fertility after deep intrauterine insemination in non-sedated sows. Reproduction, 2002, 123: 163-170.
49. V a z q u e z  J.M.,  M a r t i n e z  E.A,  P a r r i l l a  I. e.a. Birth of piglets after deep intrauterine insemination with flow cytometrically sorted boar spermatozoa. Theriogenology, 2003, 59: 1509-1604.
50. G r o s s f e l d  R.,  K l i n c  P.,  S i e g  B. e.a. Production of piglets with sexed semen employing a non-surgical insemination technique. Theriogenology, 2005, 63: 2269-2277.
51. V a z q u e z  J.M.,  M a r t i n e z  E.A.,  P a r r i l l a  I. e.a. Improving the efficiency of laparoscopic intraoviductal insemination with sex-sorted boar spermatozoa. Reprod. Fertil. Dev., 2006, 18: 283.
52. G a r c i a  E.M.,  V a z g u e s  J.M.,  P a r r i l l a  I. e.a. Improving the fertilizing ability of sex sorted boar spermatozoa. Theriogenology, 2007, 68: 771-778.
53. P a r r i l l a  I.,  V a z q u e s  J.M.,  C u e l l o  C. e.a. Hoechst 33342 stain and UV laser exposure do not induce genotoxic effect in flow-sorted boar spermatozoa. Reproduction, 2004, 128: 615-621.
54. B a t h g a t e  R.,  G r o s s f e l d  R.,  S u s e t i o  D. e.a. Early pregnancy loss in sows after low dose deep uterine artificial insemination with sex-sorted, frozen-thawed sperm. Animal Reprod. Sci., 2008, 104: 440-444.
55. C a t t  S.L.,  C a t t  J.W.,  G o m e z  M.C. e.a. Birth of a male lamb derived from in vitro matured oocyte fertilized by intracytoplasmic injection of a single «male» sperm. Vet. Record, 1996, 139: 494-495.
56. C r a n  D.G.,  M c K e l v e y  W.A.,  K i n g  M.E. e.a. Production of lambs by low dose intrauterine insemination with flow cytometrically sorted and unsorted sperm. Theriogenology, 1997, 47: 267.
57. D e  G r a a f  S.P.,  E v a n s  G.,  M a x w e  l l  W.M. e.a. Successful low dose insemination of flow cytometrically sorted ram spermatozoa in sheep. Reprod. Domest. Anim., 2007, 42: 648-653.
58. B u c h a n a n  B.R.,  S e i d e l  G.E. Jr.,  M c C u e  P.M. e.a. Insemination of mares with low numbers of either unsexed or sexed spermatozoa. Theriogenology, 2000, 53: 1333-1344.
59. M o r r i s  L.H.,  H u n t e r  R.H.,  A l l e n  W.R. Hysteroscopic insemination of small numbers of spermatozoa at the uterotubal junction of preovulatory mares. J. Reprod. Fertil., 2000, 118: 95-100.
60. M a r i  G.,  R i z z a t o  G.,  I a c o n o  E. e.a. First foal born in Italy using flow cytometrically sorted spermatozoa. Reprod. Domest. Anim., 2008, 43(3): 179.
61. L i n d s e y  A.C.,  V a r n e r  D.D.,  S e i d e l  G.E. Jr. e.a. Hysteroscopic or rectally guided, deep-uterine insemination of mares with spermatozoa stored 18 h at either 5 °C or 15 °C prior to flow-cytometric sorting. Anim. Reprod. Sci., 2005, 85: 125-130.

USE OF SEMEN DIVIDED ON SEX IN PRACTICAL CATTLE BREEDING (review)

A.S. Erokhin, M.I. Dunin

The current technology of sperm dividing on sex with use of high-speed flow cytometry was discussed. The authors summarize the results of investigations of artificial insemination of cattle and other agricultural animals by divided sperm and the transplantation to them of embryos, obtained by means of divided sperm in vitro.

Key words: flow cytometry, sexed semen, artificial insemination, fertility, heifers, sheeps, sows, mares.

Оформление электронного оттиска