УДК 639.11:577.2
РЕПРОГРАММИРОВАНИЕ ГЕНОМА КЛЕТОК МЛЕКОПИТАЮЩИХ (обзор)
И.П. САВЧЕНКОВА
Обсуждаются ключевые вопросы методологии переноса кариопласта в энуклеиро-ванный ооцит на клеточном уровне. Дана оценка перспектив использования других методических приемов для репрограммирования генома высокоспециализированных клеток в направлении тоти- и полипотентности — гибридизации стволовой и дифференцированной клеток, а также обработки клеточными экстрактами.
Ключевые слова: репрограммирование ядра, ядерный перенос, энуклеация, эмбриональные стволовые клетки, тоти- и полипотентность, клеточная гибридизация, клеточные экстракты.
Основной фундаментальный вопрос биологии развития — каким образом ядра, содержащие идентичный набор генов, обеспечивают формирование различных типов клеток, остается до сих пор открытым. Изучение молекулярных механизмов и сигнальной программы тотипотентности генома клеток млекопитающих только начинается. В настоящее время еще не сложилось единое мнение относительно потенциала репрограммирования ядер стволовых и высокоспециализированных клеток. Считается, что в процессе цитодифференцировки происходит глубокая инактивация нефункционирующих генов и/или полностью утрачиваются отдельные локусы ДНК. В связи с этим степень дифференцировки клеток и их способность к метапластическим превращениям относят к показателям, определяющим такой потенциал. Справедливость подобного положения доказывают работы по клонированию амфибий и млекопитающих. История вопроса насчитывает более 50 лет (1). Действительно, первые удачные эксперименты по клонированию были выполнены при переносе в ооплазму энуклеированных ооцитов (оопласта) ядер бластомеров, полученных из ранних предымплантационных эмбрионов до стадии компактизации. Известно, что бластомеры на этой стадии развития зародышей тотипотентны и способны обеспечить полную программу развития взрослой особи. Описанный прием широко используется на протяжении многих лет в биотехнологии сельскохозяйственных животных с целью сохранения генотипа ценных высокопродуктивных особей (2). Например, деление раннего зародыша крупного рогатого скота на 8 бластомеров, перенос их в оопласт реципиента, активация, краткосрочное культивирование реконструированных комплексов и подсадка в репродуктивный тракт подготовленной самки-реципиента позволяют получить от высокоценного животного вместо одного потомка восемь. Существуют научные центры, которые полностью финансируются частным бизнесом — фермерами, заинтересованными в сохранении генотипа таких животных. Однако эмбрион может делиться только на ограниченное число бластомеров. Поэтому технология переноса ядра или ядросодержащей соматической клетки (кариопласта) взрослого организма в энуклеированный ооцит имеет большое значение для воспроизводства как сельскохозяйственных, так и диких животных. Это уникальный способ получать большее число клеток, генетически идентичных родительским, животных-клонов с ценным генотипом и перспективный подход для сохранения и воссоздания редких и исчезающих видов млекопитающих (3), особенно при использовании клеточного материала, хранящегося в криобанке при температуре жидкого азота.
Однако следует отметить, что в настоящее время репрограммирование ядра взрослой соматической клетки в первую очередь представляет интерес как прием получения полипотентных клеток млекопитающих, в том числе человека, по фенотипу подобных эмбриональным стволовым. Суть метода заключается в том, что у ооцита на стадии MII удаляется полярное тельце с метафазной пластинкой (энуклеация) и вводится ядро соматической клетки, выделенной, например, из подкожно-жировой клетчатки взрослой особи. После активации такого комплекса сконструированный зародыш краткосрочно культивируют до стадии бластоцисты, а затем из клеток внутренней клеточной массы выделяют эмбриональные стволовые клетки (ЭСК), которые будут аутологичными для донора кариопласта (4). ЭСК при определенных условиях способны воспроизвести эмбриогенез. Они временно присутствуют в эмбрионе и доступны как клеточные линии, полученные из предымплантационных эмбрионов млекопитающих. Эти клетки по своим характеристикам уникальны и близки к таковым в ранних эмбрионах (5). В предварительных экспериментах на мышах было показано, что ЭСК, которые выделены из предымплантационных эмбрионов мыши, полученных посредством ядерного переноса, так же сохраняют уникальные особенности (в том числе огромный потенциал дифференцировки в клетки различных тканей), как и ЭСК из нормальных эмбрионов мыши (6). В опытах по выяснению генетических различий между клонированными и нормальными эмбрионами мыши на стадии бластоцисты подтвердили (7), что по генной активности ЭСК, полученные от двух экспериментальных групп, абсолютно идентичны и имеют одинаковый потенциал при использовании в терапевтических целях.
В последние годы достигнуты огромные успехи в клеточной инженерии, в частности в создании новых реконструированных клеточных типов. Репрограммирование ядра соматической клетки взрослого организма (то есть восстановление ее тотипотентности под действием эпигенетических факторов, в результате чего ядро приобретает способность к реализации альтернативной генетической программы, обычно программы эмбриогенеза) убедительно продемонстрировано при переносе кариопласта в энуклеированный ооцит. Анализ данных, представленных в литературе, показал, что в настоящее время наряду с переносом ядер соматических клеток взрослого организма развиваются и другие приемы репрограммирования генома в клетках млекопитающих — в частности, гибридизация стволовой и дифференцированной клеток, а также обработка клеточными экстрактами.
Представляет интерес оценить перспективы использования этих методических приемов для репрограммирования генома высокоспециализированных клеток взрослой особи в направлении тоти- и полипотентности.
П е р е н о с я д р а с о м а т и ч е с к о й к л е т к и в э н у к л е и- р о в а н н ы й о о ц и т м л е к о п и т а ю щ и х и р е п р о г р а м м и р о в а н и е. Как показано у различных видов млекопитающих, ооплазма энуклеированных ооцитов способна запустить программу развития особи в ядре из высокодифференцированной клетки (8-10). Достоверно установлено, что у ядра после переноса в оопласт значительно изменяется структура на разных уровнях (11, 12). Поэтому перенос ядер соматических клеток в энуклеированный ооцит может служить удобной модельной системой для изучения сигнальной программы и молекулярных механизмов восстановления тотипотентности генома. Считается, что под влиянием неизвестных факторов в ядре соматической клетки происходит активация генов раннего эмбриогенеза и ингибирование генов, ответственных за дифференцировку. При полном репрограммировании «стирается» как специализированная генетическая, так и эпигенетическая информация и клетка приобретает свойство тотипотентности. Процесс репрограммирования ядра соматической клетки можно изучать на разных уровнях — экспрессии генов и ремоделирования хроматина (13, 14). Репрограммирование при переносе в оопласт достоверно подтверждено изменением генной активности. В частности, в недавно опубликованной работе (15) с помощью микрочипов был проведен сравнительный анализ более 5000 генов в трех группах экспериментальных объектов: I — эмбрионы коров, полученные с помощью переноса ядер соматических клеток, которые достигли in vitro стадии бластоцист, II — кариопласт, который использовался для создания этих эмбрионов, и III — бластоцисты коров, развивающиеся в естественных условиях. Результаты показали, что экспрессия одних и тех же генов на уровне транскрипции в реконструированных эмбрионах и донорских клетках существенно различается, но почти не отличается от экспрессии в геноме естественно полученных бластоцист. Так, 29 % генов, ответственных за процессы окислительного фосфорилирования, синтеза АТФ, цикла трикарбоновых кислот, метаболизм пуринов, пирувата, гликолиз, а также за клеточный цикл и апоптоз, по-разному экспрессировались в реконструированных эмбрионах и клетках, которые использовали в качестве кариопласта. Это свидетельствует, что геном диплоидной клетки, перенесенный в ооплазму потенциально тотипотентной клетки (ооцит), претерпевает значительное изменение под воздействием эпигенетических факторов и приобретает способность реализовать генетическую информацию развития вплоть до стадии бластоцисты. Однако было установлено, что в тканях и плаценте новорожденных клонированных мышей нарушается экспрессия импринтированных генов (16). Анализ профилей экспрессии более 10 тыс. генов в печени и плаценте новорожденных клонированных мышей, полученных в результате пересадки ядер кумулюсных клеток взрослых особей, показал, что не все гены экспрессируются нормально (17). У большинства клонированных бластоцист мышей обнаружили нарушения экспрессии гена Oct4, существенного для поддержания полипотентных свойств клеток ранних зародышей (18) (напомним, что Oct4 — транскрипционный фактор, играющий важную роль в развитии млекопитающих). Известно, что ген Oct4 экспрессируется только в тоти- и полипотентных клетках эмбрионов млекопитающих до стадии гаструляции (19). В начале 90-х годов прошлого века почти одновременно об его открытии сообщили несколько научных коллективов (20-22), назвав по-разному — Oct3 и Oct4, что привело к некоторой путанице. Впоследствии его стали называть Oct3/4 (официальное обозначение — Pou5f1, однако оно не используется). Изначально указанный ген был обнаружен в эмбриональных стволовых и эмбриональных половых клетках мыши.
Следовательно, проблемы, возникающие на более поздних стадиях развития реконструированного зародыша, не дают права утверждать, что такое перепрограммирование достаточно для дальнейшего развития организма.
Большой вклад в изучение потенциала репрограммирования у высокоспециализированной клетки внесли R. Jaenisch с соавт. (23). Они предложили новый методический прием, который позволил значительно увеличить эффективность клонирования мышей. Была применена техника переноса кариопласта в энуклеированный ооцит мыши в два этапа — «двойной перенос». Оригинальность подхода заключалась в том, что на первом этапе после краткосрочного культивирования реконструированного комплекса его использовали не для переноса в организм подготовленной самки-реципиента, а для выделения из реконструированных бластоцист ЭСК, на втором — осуществлялась тетраплоидная комплементация. ЭСК, полученные из реконструированных бластоцист, инъецировали в бластополость тетраплоидных бластоцист (24) и получили химерные особи. Технику тетраплоидной комплементации впервые предложил A. Nagy с соавт. (25). Тетраплоидные эмбрионы получают под действием электрических импульсов при слиянии внутри зародыша двух бластомеров, обладающих диплоидным набором хромосом, с образованием эмбриона с тетраплоидным набором. Считается, что такие зародыши могут развиваться до стадии имплантации, но затем происходит их дегенерация, обусловленная неспособностью формировать зародышевые структуры эмбриона. Конструирование подобных химер позволяло сделать вывод, что все зародышевые структуры эмбриона сформированы за счет потенциала ЭСК. Авторы показали (25), что ядро высокоспециализированной клетки крови способно развернуть программу развития особи вплоть до получения здорового потомства. Возможно, этого удалось добиться, используя тетраплоидные бластоцисты, так как экстраэмбриональные ткани, сформированные за счет тетраплоидных эмбрионов, могли сыграть ключевую роль в преодолении дефектов (например, увеличения плаценты), которые часто наблюдаются при использовании обычной техники клонирования мышей.
В методологии клонирования до сих пор существуют нерешенные вопросы и противоречия. Прежде всего, это касается выбора источника кариопласта. Убедительно продемонстрирована способность реализации генетической информации вплоть до получения полноценной особи у генома полипотентных клеток, перенесенного в оопласт реципиента (26). Авторы приводят сравнительные данные эффективности развития предымплантационного (до стадии бластоцист) и постымплантационного (от бластоцист до рождения потомства) мышиных зародышей, полученных посредством переноса недифференцированного и дифференцированного кариопласта в энуклеированный ооцит. В качестве дифференцированного кариопласта сравнивали клетки Сертоли, кумулюса и фибробласты, недифференцированного — бластомеры ранних зародышей, ЭСК, клетки эмбриональной карциномы. Несмотря на то, что геном дифференцированной клетки в реконструированном комплексе оказался способен репрограммироваться и запустить развитие такого химерного зародыша до стадии бластоцисты, приведенные данные твердо доказывают, что только использование в качестве кариопласта недифференцированных клеток позволяет реконструированным комплексам успешно достичь постымплантационного развития зародышей и получить из них как ЭСК, так и потомство с высокой эффективностью. При использовании в качестве кариопласта стволовых полипотентных клеток вероятность рождения жизнеспособных клонов повышается в 5-10 раз (27), однако есть и другое мнение (28). Следует подчеркнуть, что в экспериментах по переносу ядер дифференцированных соматических клеток многие исследователи ограничиваются оценкой эффективности клонирования по числу полученных предымплантационных эмбрионов, а не по рожденному потомству, что существенно искажает оценку способности дифференцированной клетки к репрограммированию.
Вопрос синхронизации клеточных циклов кариопласта и оопласта-реципиента — ключевой для клонирования. В естественных условиях состав большинства клеточных популяций стадийно гетерогенен: наряду с дифференцированными группами клеток имеются и их предшественники, находящиеся на разных стадиях клеточного цикла. Было установлено, что при переносе диплоидных (2n ДНК) ядер клеток, блокированных на G0/G1 стадиях клеточного цикла посредством культивирования в среде с низким (< 5 %) содержанием сыворотки плода коров, создаются оптимальные условия для геномного репрограммирования (29, 30). Однако бессывороточное голодание может спровоцировать апоптоз клеток (31). Учитывая, что G0-состояние не является стационарным и до сих пор определение стадий клеточного цикла при выборе кариопласта в культуре проводится исключительно на основании морфологических признаков и размеров клеток, хотелось бы подробнее остановиться на работе, в которой авторы приводят убедительные данные о существовании «универсальной» ооплазмы реципиента, позволяющей использовать несинхронизированный кариопласт (32).
Было установлено, что успех репрограммирования кариопласта зависит от фактора инициации M-фазы созревания/мейоза/митоза (ФИM). Он представляет собой комплекс двух белков — циклина и p34cdc2 и инициирует переход клетки из интерфазы (G0) в метафазу (М). Во время клеточного цикла концентрация p34cdc2 остается неизменной, а циклина — варьирует. Протеиназная активность ФИМ регулируется изменениями в статусе фосфорилирования клеточного цикла и его ассоциацией с циклином. Активность p34cdc2-киназного триггера регулирует вступление клетки в митоз или мейоз, в результате которого происходит разрыв ядерной оболочки, конденсация хромосом, реорганизация цитоскелета и изменение клеточной морфологии (33). Активность ФИМ существенно варьирует в оогенезе: она максимальна в течение созревания ооцита в метафазе как I, так и II мейотического деления и минимальна после оплодотворения или искусственной активации ооцита. Когда зрелый ооцит 2-го порядка блокирован в МII фазе, содержание ФИМ характеризуется высокими значениями. Было установлено, что если переносить кариопласт в зрелый ооцит до или во время активации, то есть на фоне высокой активности ФИМ, у всех ядер, перенесенных в такой оопласт, наблюдается разрыв ядерной оболочки и конденсация хромосом. В этот период ДНК подвергается репликации. Поэтому в такой оопласт очень важно вносить синхронизированный кариопласт на стадиях G1/G0 (2n ДНК). Использование кариопласта на других стадиях клеточного цикла — G2 (4n ДНК) или S (2-4n ДНК) приводит к преждевременной конденсации хромосом, как следствие, к их пульверизации и аномалиям плоидности. Этого можно избежать, если использовать ооплазму реципиента после снижения содержания ФИМ (например, активировав ооцит на стадии MII перед энуклеацией). Иcпользование «универсальной» ооплазмы реципиента позволяет переносить кариопласт на стадиях G1, S, G2 клеточного цикла без синхронизации.
Есть мнение, что ДНК кариопласта, перенесенного в ооцит с низкой активностью ФИМ, правильно реплицируется, однако репрограммирование такого кариопласта часто остается неполным (13). В связи с этим хотелось бы отметить, что большинство исследователей выбирают в качестве источника оопласта не зиготу, которая характеризуется низким содержанием ФИМ, а ооцит на стадии MII. Однако, учитывая особенности партогенеза женских гамет, можно предположить, что активность цитоплазматических факторов ооцита, контролирующих процесс репрограммирования донорских ядер, сопоставима с таковой у зигот. Известно, что после завершения периода ооцитарного роста последующие стадии созревания, оплодотворения яйцеклеток и, что особенно важно, дробления зигот протекают исключительно за счет синтезированных ранее цитоплазматических факторов (34). В то же время ооцит MII и зигота имеют разные биологические свойства. Ооцит 2-го порядка представляет собой развивающуюся яйцеклетку, прошедшую I мейотическое деление, развитие которой остановилось. Часть ДНК этой клетки находится в первом полярном тельце, а остальная представлена метафазной пластинкой и сосредоточена непосредственно в цитоплазме; ядерный хроматин не отделен от ооплазмы ядерной оболочкой. Зигота же представляет слившуюся клетку, в которой имеется мужской и женский пронуклеусы с гаплоидным набором хромосом. Во время энуклеации ооцита в его ооплазме могут оставаться ядерные факторы, ответственные за репрограммирование, а в зиготе они могут быть удалены во время энуклеации, так как располагаются в ядре и отделены ядерной оболочкой. I.A. Polejaeva соавт. (35), которые в отличие от других исследователей последовательно использовали в качестве кариопласта два источника — энуклеированный ооцит на стадии MII и зиготу, удалось значительно увеличить эффективность клонирования свиней (до 7 %). На первом этапе они перенесли клетки кумулюса в энуклеированный ооцит и активировали реконструированный клеточный комплекс импульсами электрического тока до формирования двух пронуклеусов, на втором — полученные пронуклеусы (кариопласт) из ооцитов микроинъецировали в предварительно энуклеированные зиготы. Активированные импульсами электрического тока реконструированные зиготы переносили в репродуктивный тракт суррогатных самок, получив в результате здоровое потомство.
Считается, что ооплазма яйцеклеток крупного рогатого скота обогащена белками-сайленсерами хроматина (Oct4, Tcf, Groucho). Опосредованная этими белками особо компактная упаковка гетерохроматина неизвестным пока способом коррелирует с тотипотентностью генома клетки. В попытках улучшить взаимодействия между ооплазмой реципиента и донорским ядром был предложен новый методический подход (36). Авторы высказали гипотезу, что для полноценного взаимодействия дифференцированного ядра с оопластом ооцита на стадии МII требуется более длительное время. Они обнаружили, что кариопласт, который до активации оставался в окружении ооплазмы по крайней мере 6 ч, способен запустить программу развития особи с высокой эффективностью. Эта работа уникальна тем, что впервые была показана возможность получать межвидовые зародыши посредством ядерного переноса. Ооплазма энуклеированного ооцита коров оказалась способной перепрограммировать геном узкоспециализированных клеток (фибробластов) не только этого же вида, но и других видов животных — овцы, свиньи, обезьяны и крысы. Эффективность получения сконструированных эмбрионов корова—корова, корова—овца, корова—свинья, корова—обезьяна и корова—крыса на стадии двух бластомеров равнялась соответственно 55,8; 66,0; 52,2; 93,7 и 90,2 %. При имплантации сконструированных клеточных комплексов в матку предварительно подготовленных суррогатных матерей того вида животных, от которого был получен кариопласт, в вариантах с коровами и овцами получили соответственно стельности и суягности. Однако у овец на 32-е сут после переноса у плодов не обнаружили сердцебиение. Тем не менее, было убедительно продемонстрировано, что у эмбрионов, сконструированных in vitro, сроки развития характерны для того вида животных, от которого взят кариопласт. Известно, что ранний предымплантационный эмбрион коровы достигает стадии бластоцисты на 7-е сут после оплодотворения, сконструированные межвидовые эмбрионы овца—корова — на 5-е сут после активации, что соответствует развитию овечьего зародыша после естественного оплодотворения в репродуктивном тракте овцы. Эмбрионы, полученные посредством переноса фибробластов обезьяны, развивались в культуре медленнее и достигали стадии бластоцисты на 8-е сут, что также соответствует срокам естественного развития эмбрионов у обезьян использованного вида. Возможно, эта работа открывает новые перспективы применения ооцитов животных для получения ЭСК человека: если будет доказана безопасность подобных межвидовых клеточных комплексов, то решится основной вопрос о недостатке ооцитов человека и источниках их получения.
Недавно появилось сообщение китайских ученых о создании аутологичных ЭСК человека на основе клеток зародышевого узелка бластоцист, полученных в результате переноса фибробластов человека в энуклеированный ооцит кролика (37). Ранее было показано, что кроличий ооцит способен репрограммировать ядро соматической клетки как своего (38), так и другого вида животных (39). В этой работе исследователи сравнивали потенциал репрограммирования фибробластов человека, выделенных от доноров четырех возрастных групп (5, 42, 52 и 60 лет), и пришли к заключению, что ядро высокоспециализированной клетки способно репрограммироваться под воздействием ооплазмы кроличьего ооцита независимо от возраста донора кариопласта. Созданные реконструированные межвидовые клеточные комплексы кролик—человек развивались in vitro успешно до стадии бластоцисты, что позволило получить из них посредством диссоциации внутренней клеточной массы аутологичные ЭСК человека: при анализе ДНК, выделенной из фибробластов-доноров, и ЭСК, подвергнутых дифференцировке, по 14 маркерным сателлитам выявили идентичность исследуемых образцов, что, однако, требует достоверного подтверждения в других лабораториях.
Таким образом, события, происходящие после переноса кариопласта в оопласт реципиента, изучены недостаточно. Степень ремоделирования, которая делает возможным перепрограммирование введенного генома до эмбрионального состояния, зависит от многих факторов, в том числе от источника кариопласта, стадий клеточного цикла оопласта и кариопласта. Чтобы ответить на вопрос, какая комбинация оптимальна для индукции нового витка эмбрионального развития, необходимы исследования по оптимизации условий эпигенетического репрограммирования донорских ядер соматических клеток как до, так и после их пересадки в оопласт, а заявления об использовании этой технологии применительно к человеку преждевременны.
Р е п р о г р а м м и р о в а н и е г е н о м а п о с р е д с т в о м г и б- р и д и з а ц и и д и ф ф е р е н ц и р о в а н н о й и с т в о л о в о й к л е т о к. В настоящее время накапливаются данные о том, что в гибридных клетках, полученных посредством слияния ЭСК и высокоспециализированных клеток, наблюдается репрограммирование генома последних, в результате чего дифференцированные клетки приобретают свойства, характерные для полипотентных (40-42).
Методы гибридизации соматических клеток давно и широко применяются при решении различных теоретических проблем биологии и многих практических задач медицины. Гибридные клетки используются при исследовании действия генов и их регуляции, механизмов клеточной дифференцировки, проблем злокачественного роста опухолей, взаимодействия ядра и цитоплазмы, а также вирусов и клеток-хозяев. Гибриды соматических клеток стали основой для развития одной из перспективных отраслей биотехнологии — получения моноклональных антител с помощью гибридомной техники (43). Для гибридизации соматических клеток применяют несколько подходов. Наиболее широко распространен метод слияния ЭСК, дефектных по ферменту, позволяющий вести селекцию (обычно по гипоксантингуанин-фосфорибозилтрансферазе — ГФРТ). Дополнительное удобство этого маркера в том, что ген Hprt находится в Х-хромосоме, то есть, подбирая соответствующий генотип клеток, можно дополнительно проследить модификации генома на уровне хромосом. Известно, что клетки с фенотипом ГФРТ- погибают при культивировании в среде, которая содержит гипоксантин, аминоптерин и тимидин (ГАТ). Использование среды ГАТ позволяет отобрать клоны клеток с фенотипом ГФРТ+. Репрограммирование генома клеток посредством гибридизации ЭСК и высокоспециализированных клеток было впервые предложено группой российских ученых из Новосибирска (44). Прием использовали для слияния ЭСК мыши линии HM-1 (генотип ХY), дефектной по ферменту ГФРТ, со спленоцитами (генотип ХХ) в присутствии полиэтиленгликоля (ПЭГ). Полученные гибридные клетки имели тетраплоидный набор хромосом. Была показана гетерогенность клеточных клонов по наличию трисомий и хромосомных перестроек. В результате авторам удалось отобрать сбалансированный по хромосомному составу клеточный клон, пригодный для получения химерных или клонированных мышей. Гибридные клетки экспрессировали эмбриональные антигены и при индукции к дифференцировке формировали эмбриоидные тельца, которые были представлены клетками всех трех типов зародышевых листков. Кроме того, такие гибридные клетки сохраняли высокую полипотентность — при введении в полость бластоцист принимали участие в образовании многих тканей и органов химер. Интересным оказался тот факт, что, несмотря на контакт полипотентного и дифференцированного геномов в процессе образования гибридной клетки и присутствие X-хромосомы узкоспециализированной клетки в кариотипе сконструированных клеточных агрегатов, полипотентность проявлялась как доминантный признак (на селективной среде сохранялась Х-хромосома спленоцита). Детальный анализ сегрегации родительских хромосом у внутривидовых гибридных клеток выявил, что она носит двусторонний характер. Используя этот необычный феномен, удалось получить полипотентные гибридные клетки, в которых собственная «полипотентная» Х-хромосома была замещена на «дифференцированную». Анализ химерных животных, полученных введением гибридных клеток в полость бластоцист, показал, что Х-хромосома спленоцитов способна репрограммироваться в геноме гибридных клеток, поскольку белковый продукт ее маркерного гена обнаружен во многих тканях химер.
Другой прием основан на использовании генетически трансформированных клеток, которые получают посредством введения экзогенной ДНК или выделяют от трансгенных животных. Как в первом, так и во втором варианте обычно используют рекомбинатную ДНК, которая содержит последовательности гена GFP под контролем промотора гена Oct4: ген, поставленный под контроль такого промотора, может экспрессироваться только в полипотентных ЭСК. Использование в качестве маркерного гена GFP позволяет оценить степень гибридизации под флуоресцентным микроскопом и отделить неслившиеся клетки от слившихся с ЭСК при проточной цитофлуориметрии. Этот прием использовался для репрограммирования тимоцитов (45) и клеток нейросфер (46). Нейросферы получали от мышей линии OG/Rosa26, трансгенных по генам Oct4-GFP и neo/lacZ. Это позволяло контролировать процесс гибридизации клеток в УФ-свете и отбирать гибридные клоны в селективной среде, содержащей генитицин (G418). В работе была предпринята попытка определить, цитоплазма или ядро ЭСК содержат факторы, которые способны репрограммировать геном дифференцированной клетки, для чего ядра ЭСК отделяли от цитоплазмы в градиентах фиколла, предварительно поместив клетки в среду с цитохалазином В (конечная концентрация 10 мкМ) на 20 ч. Собранные ядра и цитопласт ЭСК по отдельности сливали с клетками нейросфер. Только при слиянии ядер ЭСК с клетками нейросфер получили колонии с фенотипом Neo+. На 2-е сут после слияния наблюдали реактивацию гена GFP в гибридах. Частота репрограммирования на 5-м пассаже культивирования составляла 95 % и была стабильной длительное время. Слившиеся гибриды и ЭСК формировали колонии со сходным фенотипом, подобным ЭСК. У них выявили экспрессию основных маркеров полипотентности — Oct4, Rex-1 и nanog, но маркер эктодермы — ген рецептора глютамата (GluR6) не экспрессировался. Цитогенетическим анализом установили у полученных гибридов тетраплоидный набор хромосом. В этих опытах цитоплазма ЭСК оказалась неспособной реактивировать геном высокодифференцированной клетки. Отметим, однако, что сделанный вывод не касается ооплазмы ооцита. Известно, что ооцит млекопитающих имеет размер 100-120 мкм в зависимости от вида животного, в то время как ЭСК в 10 раз меньше — 10 мкм. У ЭСК высокое ядерно-цитоплазматическое отношение (ядро занимает почти всю клетку), цитоплазма примитивна и представлена узким ободком. Поэтому энуклеация ЭСК в методическом аспекте сомнительна.
Факт перепрограммирования дифференцированного ядра клетки до состояния полипотентности при слиянии дифференцированной клетки со стволовой был ранее показан на другой клеточной модели (47). Для этого использовали полипотентные эмбриональные половые клетки (ЭПК). Ранее считалось, что первичные половые клетки (ППК) мыши невозможно поддерживать в культуре более 24 ч. Однако при культивировании их в системе, схожей с предложенной для ЭСК (фидерный слой, представленный STO, и присутствие факторов, ингибирующих дифференцировку, — LIF, SCF, FGF) получили колонии с ЭСК-подобным фенотипом, которые назвали embryonic germ cells (EG) (48). Известно, что отличительная особенность ППК — отсутствие родительских отпечатков импринтинговых генов (49). Считается, что геномное репрограммирование ППК сопровождается обширным деметилированием генома, которое предупреждает его нежелательные модификации под действием эпигенетических факторов, способные передаваться последующим поколениям. Возможно, этот процесс гарантирует, что как в мужских, так и женских половых клетках гомологичные хромосомы впервые приобретают идентичный эпигенетический статус до соответствующего включения импринтинговых локусов. ЭПК, полученные из ППК, сохраняют с ними эпигенетическое сходство. Эти клетки представляют собой уникальную модель для исследования механизмов эпигенетических модификаций, которые происходят с первичными половыми клетками. Слияние таких клеток с высокоспециализированными клетками позволяет исследовать природу эпигенетических изменений в половых клетках. Было продемонстрировано, что ЭПК индуцируют репрограммирование соматических ядер в гибридных клетках в результате обширного деметилирования маркированных локусов. Более того, результатом их реактивации было деметилирование спящих материнских аллелей импринтинговых генов. Таким образом, установлено, что ЭСК и ЭПК могут опосредовать некоторые стадии эпигенетического репрограммирования соматических генов.
Клеточные гибриды между эмбриональными стволовыми и дифференцированными клетками служат уникальным объектом для исследования возможности репрограммирования индивидуальных хромосом, перенесенных из дифференцированной соматической клетки в полипотентную гибридную (50). Однако следует констатировать, что применение этого подхода для получения полипотентных клеток преждевременно. Процесс дедифференцировки требует дополнительных экспериментальных подтверждений. Кроме того, недостатками метода остаются низкая частота слияния, аномалии хромосомного набора (тетраплоидия) и нестабильность генома гибридных клеток. Необходимо учитывать и то, что для получения гибридных клеток используют мутантные или генетически трансформированные (генетически маркированные) линии ЭСК, что исключает возможность применения таких клеток в регенерационной медицине.
К л е т о ч н ы е э к с т р а к т ы и р е п р о г р а м м и р о в а н и е
г е н о м а д и ф ф е р е н ц и р о в а н н ы х к л е т о к,
к у л ь т и в и р у е м ы х i n v i t r o. Считается, что терминальная дифференцировка клетки необратима, однако накапливаются данные, противоречащие такому утверждению. Так, было показано, что дифференцированные эндотелиальные клетки могут трансдифференцироваться в кардиомициты при культивировании в присутствии кардиомицитов или при пересадке в сердце мыши, перенесшей ишемию (51). При изучении влияния экстрактов, полученных из ядра или цитоплазмы соматических клеток, на репрограммирование генома (52, 53) были выбраны высокоспециализированные клетки крови — Т-лимфоциты, которые значительно различаются в состоянии покоя и активации. Известно, что антиген-опосредуемая (АТ анти-СD3) активация Т-лимфоцитов периферической крови человека индуцирует ремоделирование хроматина и активацию некоторых генов, включая ген интерлейкина 2 (IL-2). В регуляцию гена IL-2 включаются белки-активаторы HFAT, AP-1, NFkB, конституционный транскрипционный фактор Осt1 и активируемая митогеном протеинкиназа Erk. Была предпринята попытка оценить способность цитоплазматических и ядерных экстрактов, полученных из Т-лимфоцитов, активация которых подтверждалась экспрессией гена IL-2, ремоделировать хроматин в покоящихся Т-лимфоцитах. Для обеспечения проницаемости клеточной мембраны для экстрактов клетки предварительно обрабатывали бактериальным токсином (Streptolysin O). Оказалось, что ядерное репрограммирование может быть индуцировано экстрактами очищенных ядер, полученными из активированных лимфоцитов. Ацетилирование гистона Н4 в проксимальном районе промотора гена IL-2 указывало на активное ремоделирование хроматина в обработанных клетках.
Позже появилось сообщение, что эпителиальные клетки почки линии 293Т, обработанные экстрактом из недифференцированных клеток карциномы человека NCCIT, приобретают свойства последних (54). Эпителиальные клетки сначала обрабатывали SLO-антителами, блокирующими K-каналы на клеточной мембране, что делает ее проницаемой, затем (в течение 1 ч) экстрактом недифференцированных клеток карциномы (в контроле использовали экстракты, полученные из клеток 293Т). Оценивали морфологию клеток и экспрессию генов в течение 8-12 нед. Было продемонстрировано, что при использовании экстракта недифференцированных клеток обработанные клетки приобретали черты, характерные для эмбриональных карцином: росли колониями, представленными мелкими плотно упакованными клетками (что свойственно клеткам NCCIT). Анализ экспрессии генов, выполненный с помощью микрочипов, показал, что переход от фенотипа 293T к полипотентному сопровождается изменением экспрессии сотен генов NCCIT. Следует отметить, что изменение было непродолжительным (8-12 нед культивирования), однако при сравнении с предыдущими результатами (1 нед) очевидно, что эффективность обработки экстрактами из полипотентных клеток значительно выше, чем экстрактами из дифференцированных.
В этой работе также были представлены результаты обработки перевиваемых эмбриональных фибробластов мыши линии 3Т3 экстрактом, полученным из ЭСК, и подтверждена активация гена Oct4. Такие фибробласты приобретали некоторые свойства полипотентных клеток и при индукции формировали клетки всех трех типов зародышевых листков (наблюдали нейро-, остео-, адипогенную и эндотелиальную дифференцировку). Следовательно, в экстракте недифференцированных клеток карциномы и ЭСК содержатся факторы, которые, возможно, способны репрограммировать геном высокоспециализированной клетки в направлении полипотентности.
Необходимо подчеркнуть, что речь идет о начале разработок в этой области. Нужны достоверные доказательства изменения экспрессии эмбриональных генов в высокоспециализированной клетке. Такие исследования не исключают возможности существования набора биохимических факторов, способных управлять репрограммированием генома. На сегодняшний день мнения по этому поводу противоречивы. Тем не менее, можно утверждать, что экстракты, полученные из гамет или стволовых клеток, могут быть перспективными для изучения процессов ремоделирования хроматина.
Итак, cерией успешных экспериментов продемонстрировано, что ооцит может репрограммировать ядро дифференцированной клетки взрослого организма в обратном направлении до состояния тоти- и полипотентности. Это открывает новые возможности для получения эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) млекопитающих посредством ядерного переноса. Вопрос о том, способны ли ЭСК репрограммировать геном узкоспециализированной клетки до состояния полипотентности в чашке Петри без использования ооцита, остается открытым.
Л И Т Е Р А Т У Р А
1. G u r d o n J.B., B y r n e J.A. The first half-centure of nuclear transplantation. PNAS USA, 2003, 100: 8048-8052.
2. З а в е р т я е в Б.П. Биотехнология в воспроизводстве и селекции крупного рогатого скота. Л., 1989.
3. H o l t W.V., P i c k a r d A.R., P r a t h e r R.S. Wildlife conservation and reproductive cloning. Reproduction, 2004, 127: 317-324.
4. H a d j a n t o n a k i s A.-K., P a p a i o a n n o u V.E. Can mammalian cloning combined with embryonic stem cell technologies be used to treat human diseases? Genome Biol., 2002, 3: 1023.1-1023.6.
5. С а в ч е н к о в а И.П., З и н о в ь е в а Н.А., Б у л л а Й. и др. Эмбриональные стволовые клетки, их генетическое изменение путем гомологичной рекомбинации и использование в получении трансгенных животных. Усп. совр. биол., 1996, 116: 78-92.
6. J a e n i s c h R. Human cloning — the science and ethics of nuclear transplantation. N. Engl. J. Med., 2004, 5: 2787-2791.
7. B r a m b r i n k T., H o c h e d l i n g e r K., B e l l G. e.a. ES cells derived from cloned and fertilized blastocysts are transcriptionally and functionally indistinguishable. PNAS USA, 2006, 103: 933-938.
8. S o l t e r D. Mammalian cloning: advances and limitations. Nat. Rev. Genet, 2000, 1: 199-207.
9. R i d e o u t I.W., E g g a n K., J a e n i s c h R. Nuclear cloning and epigenetic reprogramming of the genome. Science, 2001, 293: 1093-1098.
10. C o l m a n A. Somatic cell nuclear transfer in mammals: progress and applications. Cloning, 1999/2000, 1: 185-200.
11. P r a t h e r R.S., K u h h o l z e r B., L a i L. e.a. Changes in the structure of nuclei after transfer to oocytes. Cloning, 2000, 2: 117-122.
12. S h i W., Z a k h a r t c h e n k o V., W o l f E. Epigenetic reprogramming in mammalian nuclear transfer. Differentiation, 2003, 71: 91-113.
13. W a d e P.A., K i k y o N. Chromatin remodeling in nuclear cloning. Eur. J. Biochem., 2002, 269: 2284-2287.
14. L a u r i n c i k J., M a d d o x - H y t t e l P. Nucleolar remodeling in nuclear transfer embryos. Adv. Exp. Med. Biol., 2007, 591: 84-92.
15. S m i t h S.L., E v e r t s R.E., T i a n X.C.e.a. Global gene expression profiles reveal significant nuclear reprogramming by the blastocyst stage after cloning. PNAS USA, 2005, 102: 17582-17587.
16. H u m p h e r y s D., E g g a n K., A k u t s u H. e.a. Abnormal gene expression in cloned mice derived from embryonic stem cell and cumulus cell nuclei. PNAS USA, 2002, 99: 12889-12894.
17. H u m p h e r y s D., E g g a n K., A k u t s u H. e.a. Epigenetic instability in ES cells and cloned mice. Science, 2001, 293: 95-97.
18. B o i a n i M., E c k a r d t S., S c h o l e r H.R. e.a. Oct4 distribution and level in mouse clones: consequences for pluripotency. Genes & Development, 2002, 16: 1209-1219.
19. P a l m i e r i S.L., P e t e r W., H e s s H. e.a. Oct4 transcription factor is differentially expressed in the mouse embryo during establishment of the first two extraembryonic cell lineages involved in implantation. Dev. Biol., 1994, 166: 259-267.
20. O k a m o t o K., O k a z a w a H., O k u d a A. e.a. A novel octamer binding transcription factor is differentially expressed in mouse embryonic cells. Cell, 1990, 60: 461-472.
21. R o s n e r M., V i g a n o M.A., O z a t o K. e.a. A POU-domain transcription factor in early stem cells and germ cells of the mammalian embryos. Nature, 1990, 345: 686-692.
22. S c h o l e r H.R., R u p p e r t S., S u z u k i N. e.a. New type of POU domain in germ line-specific protein Oct-4. Nature, 1990, 344: 435-439.
23. H o c h e d i n g e r K., J a e n i s c h R. Monoclonal mice generated by nuclear transfer from mature B and T donor cells. Nature, 2002, 415: 1035-1038.
24. E g g a n K., A k u t s u H., L o r i n g J. e.a. Hybrid vigor, fetal overgrowth, and viability of mice derived by nuclear cloning and tetraploid embryo complementation. PNAS USA, 2001, 98: 6209-6214.
25. N a g y A., R o s s a n t J., N a g y R. e.a. Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells. PNAS USA, 1993, 90: 8424-8428.
26. H o c h e d l i n g e r K., J a e n i s c h R. Nuclear reprogramming and pluripotency. Nature, 2006, 441: 1061-1067.
27. R i d e o u t W.M., E g g a n K., J a e n i s c h R. Nuclear cloning and epigenetic reprogramming of the genome. Science, 2001, 293: 1093-1098.
28. I n o u e K., O g o n u k i N., M i k i H. e.a. Inefficient reprogramming of the hematopoietic stem cell genome following nuclear transfer. J. Cell. Sci., 2006, 119: 1985-1991.
29. P r a t h e r R.S., S t u m p f T.T., R i c k o r d s L.F. Nuclear transplantation as a method of producing genetically identical livestock. Anim. Biotech., 1992, 3: 67-79.
30. R o n o T. Nuclear transfer and reprogramming. Rev. Reprod., 1997, 2: 74-80.
31. Z e t t e r b e r g A., L a r s o n O. Cell cycle progression and cell growth in mammalian cells: kinetic aspects of transition events. In: Cell cycle сontrol /C. Hutchison, D.M. Glover (eds). N.-Y., 1995: 206-227.
32. C a m p b e l l K.S., L o i P., O t a e g u i P. e.a. Cell cycle co-ordination in embryo cloning by nuclear transfer. Rev. Reprod., 1996, 1: 40-46.
33. N u r s e P. Universal control mechanism regulating the onset of M-phase. Nature, 1990, 344: 503-507.
34. Д ы б а н П. Раннее развитие млекопитающих. Л., 1988.
35. P o l e j a e v a I.A., C h e n S.-H., V a u g h t T.D. e a. Cloned pigs produced by nuclear transfer from adult somatic cells. Nature, 2000, 407: 86-90.
36. D o m i n i c o T., M i t a l i p o v a M., H a l e y B. e.a. Bovine oocyte cytoplasm supports development of embryos produced by nuclear transfer of somatic cell nuclei from various mammalian species. Biol. Reprod., 1999, 60: 1496-1502.
37. C h e n Y., H e Z.X., L i u A. e.a. Embryonic stem cells generated by nuclear transfer of human somatic nuclei into rabbit oocytes. Cell Res., 2003, 13: 251-264.
38. C h e s n e P., A d e n o t P.G., V i g l i e t t a C. e.a. Cloned rabbits produced by nuclear transfer from adult somatic cells. Nat. Biotechnol., 2002, 20: 366-369.
39. C h e n D.Y., S u n Q.Y., L i u J.L. e.a. Dedifferentiation of giant panda (Ailuropoda melanoleuca) somatic nuclei in rabbit ooplasm and early development of the reconstructed egg. Sci. China, 1999, 29: 324-330.
40. T a d a T., T a d a M. Toti-/pluripotential stem cells and epigenetic modifications. Cell Struct. Func., 2001, 26: 149-160.
41. A m b r o s i D.J., R a s m u s s e n T.P. Reprogramming mediated by stem cell fusion. J. Cell. Mol. Med., 2005, 9: 320-330.
42. A m b r o s i D.J., T a n a s i j e v i c B., K a u r A. e.a. Genome-wide reprogramming in hybrids of somatic cells and embryonic stem cells. Stem Cells, 2007, 25: 1104-1113.
43. К у щ А.А., Д ь я к о н о в Л.П., Т у г и з о в Ш.М. и др. Методы клеточной инженерии. В кн.: Животная клетка в культуре. М., 2000: 187-218.
44. M a t v e e v a N.M., S h i l o v A.G., K a f t a n o v s k a y a E.M. e.a. In vitro and in vivo study of pluripotency in intraspecific hybrid cells obtained by fusion of murine embryonic stem cells with splenocytes. Mol. Reprod. Dev., 1998, 50: 128-138.
45. T a d a M., T a k a h a m a Y., A b e K. e.a. Nuclear reprogramming of somatic cells by in vitro hybridization with ES cells. Curr. Biol., 2001, 11: 1553-1558.
46. D o J.T., S c h o l e r H.R. Nuclei of embryonic stem cells reprogram somatic cells. Stem Cells, 2004, 22: 941-949.
47. T a d a M., T a d a T., L e f e b v r e L. e.a. Embryonic germ cells induce epigenetic reprogramming of somatic nucleus in hybrid cells. EMBO J., 1997, 16: 6510-6520.
48. M a t s u i Y., Z s e b o K., H o g a n L. Derivation of pluripotential embryonic stem cells from murine primordial germ cells in culture. Cell, 1992, 70: 841-847.
49. S t e w a r t C.L., G a d i I., B h a t t H. Stem cells from primordial germ cells can reenter the germ line. Dev. Biol., 1994, 161: 626-628.
50. S e r o v О., M a t v e e v a N., K u z n e t s o v S. e.a. Embryonic hybrid cells: a powerful tool for studying pluripotency and reprogramming of the differentiated cell chromosomes. An. Acad. Bras. Cienc., 2001, 73: 561-568.
51. C o n d o r e l l i G., B o r e l l o U., D e A n g e l i s L. e.a. Cardiomyocytes induce endothelial cells to trans-differentiate into cardiac muscle: implications for myocardium regeneration. PNAS USA, 2001, 98: 10733-10738.
52. L a n d s v e r k H.B., H a k e l i a n A.-M., K u n t z i g e r T. e.a. Reprogrammed gene expression in a somatic cell-free extract. EMBO report, 2002, 3: 384-389.
53. C o l l a s P. Nuclear reprogramming in cell-free extracts. Philos. Trans. Royal Soc. Lond. B. Biol. Sci., 2003, 29: 1389-1395.
54. T a r a n g e r C.K., N o e r A., S o r e n s e n A.N. e.a. Induction of dedifferentiation, genomewide transcriptional programming, and epigenetic reprogramming by extracts of carcinoma and embryonic stem cells. Mol. Biol. Cell, 2005, 16: 5719-5735.
REPROGRAMMING OF A CELLS MAMMALIAN GENOME (review)
I.P. Savchenkova
The key questions of nuclear transfer methodology at a cell level are discussed. The recon-struction of embryos by transfer of human cells into enucleated oocytes is one potential source of pluripotent embryonic stem cells. The alternative methods of a cell mammalian genome reprogram-ming: hybridization between stem and differentiated cells and treatment by cell extract are discussed.
Key words: nuclear reprogramming, nuclear transfer, enucleation, embryonic stem cells, toti-and pluripotent, cellular hybridization, cell-free extracts.
ГНУ Всероссийский НИИ экспериментальной |
Поступила в редакцию |
Оформление электронного оттиска
