doi: 10.15389/agrobiology.2019.5.990rus
УДК 635.21:632.4:577.21
Работа поддержана грантом РНФ № 18-16-00073. Отбор образцов и их описание выполнены при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации (Соглашение № 14.607.21.0178, RFMEFI60717X0178).
АНАЛИЗ МИКОБИОТЫ В ПОРАЖЕННЫХ ЛИСТЬЯХ КАРТОФЕЛЯ
(Solanum tuberosum L.) С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МЕТАГЕНОМНЫХ
ПОДХОДОВ
А.А. КИЧКО1, Т.С. АКСЕНОВА1, В.М. ШАПКИН1, А.О. ЗВЕРЕВ1,
А.В. ХЮТТИ2, Е.Е. АНДРОНОВ1, 3, 4
Проблема поражения картофеля заболеваниями, вызванными грибами и грибоподобными организмами, актуальна для всех регионов мира, где возделывается эта культура, поскольку именно они наносят растениям самый значительный ущерб (A. Bernreiter, 2017). Традиционные подходы для идентификации патогенов картофеля нацелены на детекцию конкретного патогена и не учитывают ни другие (часто неизвестные) патогены, ни полезную микробиоту филлосферного сообщества, нарушения которой также могут стать одной из причин заболеваний. В нашей работе впервые исследована патогенная и непатогенная грибная и грибоподобная микрофлора с применением метагеномного подхода. Впервые показано, что реальная картина имеет комплексный и не вполне однозначный характер (например, основной патоген может быть минорным компонентом всего сообщества). Таксономический анализ сообществ, полученных по обоим вариантам праймеров, выявил в образце с поражением типа альтернариоз патогенный гриб рода Alternaria. Использование праймеров для амплификации региона ITS1 позволило обнаружить наличие оомицета Phytophthora и диагностировать присутствие фитофторы при обоих типах поражения. Целью нашей работы была максимально полная идентификация видового состава грибов и грибоподобных организмов, участвующих в фитопатогенезе листьев картофеля, с применением высокопроизводительного секвенирования и двух вариантов универсальных праймеров. Для анализа сообществ из образцов листьев картофеля сорта Никулинский, пораженных заболеваниями альтернариозного и фитофторозного типов, выделили ДНК, которую в дальнейшем использовали для создания ампликонных библиотек фрагментов ITS1 и ITS2 и высокопроизводительного секвенирования на приборе Illumina MiSeq («Illumina, Inc.», США). В процессе биоинформатической обработки данных при помощи программного обеспечения Illumina и программного пакета PIPITS (H.S. Gweon с соавт., 2015), получили 187 ОТЕ (операционные таксономические единицы) и 113 филотипов для библиотеки ITS1, 249 ОТЕ и 127 филотипов для ITS2. Последующее аннотирование ОТЕ и таксономический анализ сообществ проводились в программе QIIME (J.G. Caporaso с соавт., 2010), коэффициенты разнообразия внутри сообщества рассчитывались при помощи программного пакета PAST (Ø. Hammer с соавт., 2001). Сравнительная характеристика сообществ грибов и грибоподобных организмов, полученных для обоих видов поражения с использованием различных универсальных праймеров для ITS1 и ITS2, показала, что из выбранных праймеров только первая пара подходит для детекции фитофторы и дает более выравненную картину сообщества. Инструментов автоматического аннотирования результатов секвенирования оказалось недостаточно для объективной идентификации альтернарии в образцах, в связи с чем мы использовали методы ручного поиска по последовательностям в программе BLASTn (S.F. Altschul с соавт., 1990). Поскольку пара праймеров для ITS2 не учитывала присутствие фитофторы в образцах, дальнейший сравнительный анализ сообществ, характерных для двух типов поражения, проводился с использованием данных только по библиотеке ITS1. Результаты таксономического анализа показали, что на пораженных участках при обоих типах патогенеза формировалось довольно богатое сообщество грибов и грибоподобных организмов, причем в случае с поражением по типу фитофтороза доля соответствующего патогена в сообществе составляет около 30 %, а в варианте с альтернариозом — всего 2,07 %, тогда как значительная часть (около 15 %) приходится на фитофтору, что не исключает так называемого вторичного поражения. Таким образом, в сообществах, сформировавшихся на участках, пораженных заболеванием, доля патогенов составляет не более 30 %, что свидетельствует о выраженной динамике таксономического состава в зоне поражения. Очевидно, что методы высокопроизводительного секвенирования имеют весьма высокий потенциал в фундаментальных и прикладных исследованиях заболеваний растений, имеющих микробиологическую природу.
Ключевые слова: грибы, грибоподобные организмы, патогены, картофель, фитофтороз, альтернариоз, высокопроизводительное секвенирование.
A.A. Kichko1, T.S. Aksenova1, V.M. Shapkin1, A.O. Zverev1,
A.V. Khiutti2, E.E. Andronov1, 3, 4
The problem of potato diseases caused by fungi and fungi-like organisms is relevant for all regions of the world cultivating this crop, since it is mycoses that cause the most significant damage to plants (A. Bernreiter, 2017). The traditional approaches for identification of potato pathogens are aimed at identifying a specific pathogen and do not take into account neither other, often unknown pathogens, nor the other most important component — the beneficial microbiota of the phyllosphere community whose alterations can also become one of the causes of diseases. The novelty of this work lies in the fact that the high-throughput sequencing methods we used here is free of this disadvantages and makes it possible to identify virtually all plant microorganisms, including the phyllosphere and endosphere. The purpose of this study was to use metagenomic approaches to analyze the total fungal and fungi-like community in potato leaves that have morphological markers of damage by pathogens of the genus Alternaria and Phytophthora which are the causative agents of early blight and late blight. For fungal and fungi-like communities analysis, DNA samples was extracted from leaves of potato (Solanum tuberosum L.) cultivar Nikulinsky, affected by “alternaria” and “phytophthora” diseases types, which were later used to create amplicon libraries of ITS1 and ITS2 fragments and high-throughput sequencing on the Illumina MiSeq platform (Illumina, Inc., USA). During the bioinformatic data processing with the Illumina software and the PIPITS software package (H.S. Gweon et al, 2015), 187 OTE, 113 phylotypes for the ITS1 library and 249 OTE, 127 phylotypes for ITS2 were identified. Subsequent annotation of OTE and taxonomic analysis of the resulting communities were carried out with the QIIME program (J.G. Caporaso et al., 2010), the diversity coefficients within the community were calculated using the PAST software package (Ø. Hammer et al., 2001). Comparison of the fungal communities obtained for both types of lesion using different universal primers for the ITS1 regions (M. Usyk et al., 2017) and ITS2 (T.J. White et al., 1990) showed that only the first pair is suitable for the detection of phytophthora, and in general gives a more even community structure. The tools of automatic annotation turned out to be insufficient for objective identification of alternaria in samples, as a result we had to use the methods of manual search with the BLASTn program (S.F. Altschul et al., 1990). Since the primer pair ITS2 does not allow identification of Phytophthora in the samples, the further comparative analysis of the fungal communities of the two types of lesion was carried out using data only from the ITS1 library. The data of taxonomic analysis showed that in the affected areas for both types of mycoses a rich fungal community is formed, and, in the case of “late blight”, the fraction of the pathogen is about 30 % in the community, and in the variant with “early blight”, only 2.07 % with a significant part (about 15 %) accounted for by Phytophthora, which does not exclude the case of secondary lesion. Thus, it was shown that in the fungal and fungi-like communities formed in the areas affected by disease, the proportion of pathogens is no more than 30 %, which indicates a pronounced dynamics of the taxonomic composition of fungi in the affected area. It is obvious that high-throughput sequencing methods have a very high potential in fundamental and applied research on plant diseases of a microbiological nature.
Keywords: fungi, fungi-like organisms, pathogens, potato, Phytophthora infestans, Alternaria sp., high throughput sequencing.
1ФГБНУ Всероссийский НИИ сельскохозяйственной микробиологии, |
Поступила в редакцию |
