doi: 10.15389/agrobiology.2018.5.1054rus
УДК 632.51:582.28:57.083.1
Работа выполнена при поддержке гранта РНФ № 16-16-00085 «Разработка технологий получения и применения микогербицидов для борьбы с трудноискоренимыми сорными растениями».
ПОЛУЧЕНИЕ ВИРУЛЕНТНОГО ГЛУБИННОГО МИЦЕЛИЯ
Stagonospora cirsii C-163 — ПОТЕНЦИАЛЬНОГО МИКОГЕРБИЦИДА
ДЛЯ БОРЬБЫ С БОДЯКОМ ПОЛЕВЫМ Cirsium arvense (L.) Scop.
С.В. СОКОРНОВА, А.О. БЕРЕСТЕЦКИЙ
Биогербициды должны проявлять стабильную эффективность в полевых условиях, обладать специфичностью и скоростью действия, быть совместимыми с другими препаратами и востребованными на рынке. Основой микогербицидов может служить как мицелий, так и конидии фитопатогенных грибов. Мицелий менее устойчив к сушке, чем конидии. В то же время технологический процесс получения конидий зачастую сложнее, а эффективность в полевых условиях менее стабильна, чем у мицелия. Фитопатогенный гриб Stagonospora cirsii J.J. Davis, вызывающий заболевание пятнистости листьев у корнеотпрысковых сорных растений семейства Asteraceae, рассматривается как потенциальный микогербицид, предназначенный для борьбы с бодяком полевым Cirsium arvense (L.) Scop. В настоящей работе мы впервые показали, что, манипулируя составом жидкой питательной среды, можно существенно повысить патогенность мицелия гриба S. cirsii и его толерантность к высушиванию. Цель исследования — получить высокий выход вирулентного мицелия S. cirsii С-163, оптимизируя состав жидкой питательной среды по источникам углерода и азота, а также длительность глубинного жидкофазного культивирования. Посевной материал получали на картофельно-глюкозном агаре на 10-е сут. Мицелий выращивали в колбах Эрленмейра объемом 250 мл с 50 мл жидкой питательной среды на орбитальных качалках (180 об/мин) при температуре 24±2 °C в течение 2-7 сут. В жидких питательных средах варьировали источники углерода (дульцит, рамноза, L-инозит, L-арабиноза, D-сорбит, глюкоза, трегалоза, сахароза) и азота (казеин, соевый пептон, пептон ферментативный, соевая мука, желатин, лецитин, дигидрофосфат аммония, хлорид аммония, сульфат аммония, нитрат натрия), используя в качестве основы следующий состав среды: источник углерода (20 г/л), органический (10 г/л) или неорганический (3,5 г/л) источник азота, дрожжевой автолизат (1 г/л), KH2PO4 (1 г/л), MgSO4 (0,5 г/л). Значение pH жидких питательных сред доводилось до 6,0. Для установления оптимальных концентраций сахарозы и соевой муки в питательной среде, содержащей также дрожжевой автолизат (1 г/л), KH2PO4 (1 г/л), MgSO4 (0,5 г/л), изменяли количество сахарозы от 10 до 70 г/л с шагом 10 г/л и концентрацию соевой муки от 5 до 20 г/л с шагом 2,5 г/л. Степень поражения бодяка полевого в результате развития болезни оценивали по площади некрозов листовых высечек либо целых растений, находящихся в фазе розетки. Мицелий (влажность 85-87 %) высушивали в тонком слое (1-2 мм) проточным стерильным воздухом при 30 °С без протекторов в течение 3 ч. Наибольший выход мицелия выявили в варианте, когда источником углерода в питательной среде был L-инозит. Его замена на сахарозу и D-сорбит приводила к снижению выхода биомассы на 25 %. В то же время на этих средах образовывался наиболее агрессивный в отношении бодяка мицелий. При изменении источников азота максимальный выход мицелия наблюдался для казеина, соевой муки и ферментативного пептона. В процессе высушивания мицелия потери жизнеспособности пропагул оказались существенными. Наиболее устойчивым к высушиванию был мицелий, полученный на сахарозо-соевой питательной среде. Наиболее жизнеспособный мицелий, заражение которым приводило к быстрому развитию болезни и обширной некротизации листьев бодяка, образовывался в середине экспоненциальной фазы роста. Оптимизация концентрации соевой муки (15 г/л) и сахарозы (60 г/л) позволила повысить выход и агрессивность мицелия в отношении бодяка соответственно в 12 и 4 раза по сравнению с параметрами на стандартной питательной среде Чапека и существенно сократить время культивирования (3 сут). Таким образом, в результате оптимизации условий жидкофазной глубинной ферментации выход вирулентного мицелия S. cirsii возрос более чем в 10 раз и стал сопоставим с принятым в биотехнологической практике.
Ключевые слова: фитопатогенные грибы, Stagonospora cirsii, Cirsium arvense, бодяк полевой, глубинная жидкофазная ферментация, источники углерода и азота, мицелий, микогербицид.
S.V. Sokornova, A.O. Berestetskiy
The bioherbicides should exhibit stable effectiveness in the field, be specific and quick in action, compatible with other preparations and meet market demand. In many ways, the cost and quality of product is determined by the technology of obtaining infectious material. An infectious material is used as a mycelium and its modifications and as conidia as well. The extreme sensitive of the mycelium to drying is often referred as main disadvantage of using it as the basis of a formulation. At the same time, the technological process of obtaining conidia is often more complicated, and the efficiency in the field is less than the mycelium has. The phytopathogenic fungus Stagonospora cirsii J.J. Davis, which is causative agent of a leaf spot disease of creeping perennial weeds in the family Asteraceae, is considered a potential mycoherbicide of Canadian thistle Cirsium arvense (L.) Scop. However, the yield of C. cirsii C-163 mycelium on standard nutrient media is significantly lower than that used in biotechnology (3 g/l). Our paper is the first to report that manipulation with liquid nutrient medium allows a significant increase in S. cirsii mycelium pathogenicity and tolerance to exsiccation. The study is devoted to the optimization of liquid-phase deep fermentation parameters, as well as the duration of cultivation and composition of a nutrient medium, in order to obtain the C. cirsii C-163 mycelium with improved mycoherbicidal properties. This infection material is a good basis for development formulations that can be used both individually and jointly with other protective agents for perennial weed control. The advantage of the approach used in the work is that the resistance to drying, an important technological parameter which largely determines the success of the herbicides, was additionally considered, along with virulence and mycelial yield, during the optimization of fermentation parameters. The strain C. cirsii C-163 was used. The 10-day inoculum was obtained in Petri plates on potato dextrose agar medium. The mycelium was incubated in 250-ml Erlenmeyer flasks containing 50 ml of the medium at 130 rpm and 24±2 °C for 2-7 days. The base liquid nutrient media contained carbon source (20 g/l), organic (10 g/l) or inorganic (3.5 g/l) nitrogen source, yeast auto lysate (1 g/l), KH2PO4 (1 g/l), MgSO4 (0.5 g/l). Dulcite, rhamnose, L-inositol, L-arabinose, D-sorbitol, glucose, trehalose, and sucrose were a source of carbon. Casein, soy peptone, enzyme peptone, soy flour, gelatin, lecithin, ammonium dihydrogen phosphate, ammonium chloride, ammonium sulfate, and sodium nitrate were a source of nitrogen was. The pH of all liquid nutrient media was adjusted to 6.0. To establish the optimum concentrations of sucrose and soy flour in a nutrient medium with yeast auto lysate (1 g/l), KH2PO4 (1 g/l), MgSO4 (0.5 g/l), the amount of sucrose was changed from 10 to 70 g/l with a step of 10 g/l and the concentration of soy flour was changed from 5 to 20 g/l with a step of 2.5 g/l. The degree of leaf damage caused by disease was estimated by the necrosis area of leave disks or whole plants (5-6 true leaves). Drying of harvest mycelium, humidity 85-87 %, was carried out in a thin layer (1-2 mm) with flowing air at 30 °C without protectors for 3 hours. The highest yield of mycelium is when the carbon source in the nutrient medium is L-inositol. When inositol is substituted with sucrose or D-sorbitol, the biomass yield reduces by 25 %. At the same time, these nutrient media gave the most aggressive mycelium. Among nitrogen sources, the maximum yield of mycelium is in the case of casein, soy flour and enzymatic peptone. In the process of drying mycelium, loss of viability of propagules turned out to be significant. The mycelium obtained on sucrose-soy nutrient medium is the most resistant to drying. The most viable and aggressive mycelium was formed in the middle of the exponential growth phase which occurred on day 3 when cultivated in flasks on a soya-sucrose nutrient medium. Optimization of the concentration of soybean flour (15 g/l) and sucrose (60 g/l) makes it possible to increase the yield and aggressiveness of mycelium 12 and 4 times, respectively, as compared to Czapek medium. Thus, the present study provides a method for the preparation of a mycelium having a high aggressiveness to the host-plant and a capability to remain viable during drying. The prospects of such a method of obtaining an infectious material are proved.
Keywords: phytopathogenic fungi, Stagonospora cirsii J.J. Davis, Cirsium arvense (L.) Scop., Canada thistle, submerged liquid cultivation, carbon source, nitrogen source, mycelium, mycoherbicide.
ФГБНУ Всероссийский НИИ защиты растений, |
Поступила в редакцию |
