doi: 10.15389/agrobiology.2018.5.907rus
УДК 633.49:631.522/.524:577.21
Работа выполнена в рамках гранта РФФИ № 17-29-08017 и КПНИ «Развитие селекции и семеноводства картофеля».
ВАРИАБЕЛЬНОСТЬ ФРАГМЕНТА ГЕНА Pho1a У ДИКОРАСТУЩИХ
КЛУБНЕОБРАЗУЮЩИХ И НЕКЛУБНЕОБРАЗУЮЩИХ ВИДОВ
(Solanum subgenus Potatoe) И СОРТОВ КАРТОФЕЛЯ S. tuberosum L.
Е.О. ШМЕЛЬКОВА1, М.А. СЛУГИНА1, А.А. МЕЛЕШИН2, Е.З. КОЧИЕВА1
В клубнях картофеля крахмал — основной метаболит, поэтому структурно-функцио-нальный анализ генов его биосинтеза и распада и оценка их вариабельности имеет как фундаментальное, так и прикладное значение. Конечное содержание крахмала в гетеротрофных органах растений (плодах, семенах, клубнях) зависит не только от скорости биосинтеза составляющих крахмала — амилозы и амилопектина, но и от работы катаболических ферментов. Ферменты биосинтеза крахмала достаточно хорошо описаны, в то время как о механизмах разрушения крахмала мало что известно. На сегодняшний день накапливается все больше данных о важной роли крахмалфосфорилаз в этом процессе. Фосфорилазы крахмала широко распространены среди представителей растительного мира. Структура и полиморфизм гена крахмалфосфорилазы слабо изучены у двудольных растений. В клубнях картофеля разрушение крахмала осуществляется за счет L-формы крахмалфосфорилазы, которую кодирует ген Pho1a(STP23). В настоящей работе у растений картофеля впервые проведен анализ участка гена Pho1a (экзоны II-IV), кодирующего регуляторную часть функционального гликозилтрансферазного домена, в состав которого входят глюкозо-6-фосфат-связывающий сайт, сайт связывания с пиродоксальфосфатом и активный сайт связывания с глюкозой. Для изучения аллельного полиморфизма отобрали 96 образцов картофеля, включая представителей 15 дикорастущих видов подсекций Potatoeи Estolonifera, один из которых — неклубнеобразующий (S. etuberosum), а также 67 сортов и 14 линий культивируемого картофеля S. tuberosum. Ядерную ДНК выделяли из молодых листьев калий-ацетатным методом с дополнительной очисткой смесью фенола с хлороформом. Для амплификации изучаемого фрагмента была разработана праймерная комбинация Pho2F (5´-CTGAACATGAAGCAAGCGTA-3´) — Pho4R (5´-GGCTATGGACTTAGGTACA-3´). Последовательности у всех сортов и селекционных линий S. tuberosum имели протяженность 670 п.н. Длина полученных последовательностей Pho1a у видов составляла от 666 п.н. (S. vernei, S. lignicaule) до 672 п.н. (S. pinnatisectum). Всего в составе анализируемых последовательностей у 96 образцов картофеля выявили 59 точечных нуклеотидных замен (single nucleotide polymorphisms, SNPs), из них 15 локализовались в экзонах, что позволило выделить 11 аллельных вариантов, девять из которых обнаружили у дикорастущих видов. У образцов культивируемого картофеля S. tuberosum последовательности были представлены двумя аллельными вариантами. Большинство анализируемых сортов и все селекционные линии характеризовались аллельным вариантомPho1a_A2. Интересно, что он же был выявлен у картофеля, причем не только у видов надсерии Rotata, но и у эволюционно более древних видов надсерии Stellata. Аллельный вариант Pho1a_A10 обнаружили у девяти сортов российской и зарубежной селекции (Bintje, Red Scarlett, Ушконыр, Карасайский, Аврора, Aladin, Чернский, Пламя, Удача). Трансляция последовательности фрагмента Pho1aпоказала, что из15 SNPs, локализованных в экзонах, три приводили к аминокислотному замещению. У сортов с аллельным вариантом Pho1a_A10 выявлено нейтральное замещение M139I. Также две нейтральные аминокислотные замены M139L и T157S обнаружены соответственно у видов S. circaefoliumи S. vernei. Уникальное замещение R212S у неклубнеобразующего картофеля S. etuberosum является радикальным. Потенциальное влияние выявленных аминокислотных замен в таком функционально значимом районе на активность фермента крахмалфосфорилазы требует дополнительного изучения. Дальнейший поиск аллельных вариантов, ассоциированных с содержанием крахмала в клубнях картофеля может найти применение в селекционных программах.
Kлючевые слова: крахмалфосфорилаза, Pho1a,нуклеотидная и аминокислотная вариабельность, дикорастущие виды, сорта и линии картофеля, Solanum, подрод Potatoe.
Е.О. Shmelkova1, М.А. Slugina1, A.A. Meleshin2, E.Z. Kochieva1
Starch is the main metabolite in potato tubers. Therefore structure and functional analysis of starch metabolism genes are of fundamental and applied interest. The final starch amount in sink organs (fruits, seeds and tubers) depends not only on the amylose and amylopectin synthesis, but also on the catabolic enzymes activity. Proteins that participate in starch biosynthesis are rather well studied, while the starch degradation reactions are not fully understood. To date, more data on the crucial role of starch-phosphorylases in this process have been reporting. Starch phosphorylases are widespread among plant species, but the coding genes structure and genetic diversity remain unclear. In potato tubers starch is cleaved by L-form of starch phosphorylase encoded by the Pho1a (STP23) gene. In the current work Pho1a gene fragment (exon II—exon IV) variability was analyzed for the first time in 15 wild and 81 cultivated potato accessions. The chosen gene fragment corresponds to the regulatory part of the glycosyltransferase domain and comprises glucose-6-P binding site, pyridoxal phosphate cofactor binding site and active site (glucose binding). The nucleotide and amino acid polymorphism is determined. A total of 96 potato accessions were used for allelic diversity analysis: 15 wild species from Potatoe and Estolonifera subsections (where S. etuberosum is a nontuber-bearing species), 67 cultivated potato varieties and 14 breeding lines of S. tuberosum. Nuclear DNA was isolated from young leaves using potassium-acetate method with phenol-chloroform additional purification. Primer combination Pho2F (5´-CTGAACATGAAGCAAGCGTA-3´)—Pho4R (5´-GGCTA-TGGACTTAGGTACA-3´) was designed for chosen fragment amplification. The sequences of all varieties and breeding lines of S. tuberosum had a length of 670 bp. The length of the obtained Pho1a sequences in species ranged from 666 bp (S. vernei, S. lignicaule) up to 672 bp (S. pinnatisectum). Totally 59 SNPs were detected, 15 of them localized in exons. It allowed us to identify 11 allelic variants, moreover 9 of them were found in wild species. Cultivated potato S. tuberosum has two allelic variants. The Pho1a_A2 allelic variant was observed in the majority of analyzed potato cultivars and all the breeding lines. Interestingly, the same variant was detected in some wild potato species, belonging not only to superseries Rotata, but also to Stellata that is considered to be more ancient. The Pho1a_A10 allelic variant was found in 9 cultivars (Bintje, Red Scarlett, Ushkonir, Karasaiskii, Aurora, Aladin, Chernskii, Plamya, Udacha). The Pho1a gene fragment translation revealed that 3 out of 15 exonic SNPs led to amino acid substitutions. In potato cultivars with the Pho1a_A10 allelic variant neutral M139I substitution was detected. The other neutral substitutions M139L and T157S were identified in S. circaefolium and S. vernei, correspondingly. The only radical substitution R212S was detected in nontuber-bearing S. etuberosum. The potential role of the found amino acid substitutions in the functional protein domain requires the further investigation. Further search for the allelic variants associated with starch content in tubers can be used in potato breeding programs.
Keywords: starch phosphorylase, Pho1a,nucleotide and amino acid variability, wild species, potato cultivars, Solanum subgenus Potatoe.
1ФГУ ФИЦ Фундаментальные основы биотехнологии РАН, |
Поступила в редакцию |
