doi: 10.15389/agrobiology.2017.5.1012rus
УДК 633.358:631.461.5:57.052:577.112
Исследования выполнены при поддержке Российского научного фонда
(грант № 16-16-10043).
ОСОБЕННОСТИ ВЫДЕЛЕНИЯ БЕЛКОВ ДЛЯ АНАЛИЗА ПРОТЕОМА
РАСТЕНИЙ ГОРОХА Pisum sativum L. ПРИ СИМБИОЗЕ
С КЛУБЕНЬКОВЫМИ БАКТЕРИЯМИ
А.Н. КИРИЕНКО, И.В. ЛЕППЯНЕН, Э.С. ГРИБЧЕНКО, Е.А. ДОЛГИХ
Горох посевной Pisum sativum L. — удобная модель для изучения молекулярно-генети-ческих механизмов становления азотфиксирующего симбиоза с клубеньковыми бактериями, поскольку для этого вида создана представительная коллекция мутантов с нарушением процесса развития симбиоза на разных стадиях. Сравнительный анализ протеомов у исходных сортов, линий гороха и мутантов может быть удобным подходом при выявлении и анализе регуляторов, контролирующих процесс образования азотфиксирующих клубеньков. Однако, как показывает обзор данных литературы, дифференциальные изменения протеома корней гороха при симбиозе почти не изучались. Подготовка проб — ключевой этап в протеомных исследованиях. От эффективности выделения белков из исходного материала и очистки от небелковых примесей зависят качество получаемых после двумерного (2-D) электрофореза гелей и возможность их анализа. К методам выделения белков для протеомных исследований предъявляются особые требования по минимизации числа этапов работы, что необходимо для сохранности белков, а также по эффективному удалению примесей, которые могут негативно влиять на качество разделения и последующую оценку изменений в синтезе белков. Наша работа была посвящена поиску наиболее эффективного способа выделения общего пула белков из корней гороха посевного (P. sativum L.), инокулированного ризобиями. Для этого мы сравнили три метода выделения белка: стандартный, предлагаемый компанией «Bio-Rad Laboratories» (США); метод, основанный на использовании фенола и ацетата аммония; метод с применением трихлоруксусной кислоты. В работе использовали растения гороха сорта Frisson, для инокуляции применяли штамм Rhizobium leguminosarum bv. viciae CIAM1026. После выделения белков из корней проростков гороха, зараженных ризобиями (1 сут после инокуляции), было показано, что лучший результат достигается при использовании фенола с последующим осаждением белков ацетатом аммония. Гели анализировали на наличие примесей, затрудняющих поиск различающихся белковых продуктов, эффективность выделения общего белка и видимые следы деградации белков. Для выделенных белков был проведен дифференциальный 2-D электрофорез с использованием флуоресцентных меток цианин-2 (Cy2) и цианин-5 (Cy5), основанный на изоэлектрическом фокусировании белков с помощью стрипов с диапазоном рН 3-10 и последующим разделением в полиакриламидном геле (ПААГ). Установлено, что при выделении белков с помощью фенола и ацетата аммония удалось получить достаточно представительные протеомы корней проростков гороха. Дифференциальный 2-D электрофорез позволил выявить различия между контрольным вариантом (неинокулированные корни) и вариантом, полученным после инокуляции ризобиями (инокулированные корни). Разработанный метод может быть использован в дальнейшем для протеомных исследований на растениях гороха.
Ключевые слова: Pisum sativum L., горох посевной, бобово-ризобиальный симбиоз, протеомный анализ, дифференциальный 2-D электрофорез.
A.N. Kirienko, I.V. Leppyanen, E.S. Gribchenko, E.A. Dolgikh
Pea Pisum sativum L. is a convenient model to study the molecular-genetic mechanisms of nitrogen-fixing symbiosis establishment with rhizobia, because a representative collection of mutants, blocked at different stages of symbiosis development was obtained. A comparative analysis of the proteomes of the wild type cultivars and lines of peas and mutants can be a useful approach for carrying out studies aimed on at identification and further analysis of regulators controlling the formation of nitrogen-fixing nodules. However as the review of modern literary data shows, studies of differential proteome changes in pea roots during symbiosis are almost not performed. Sample preparation is a key stage in proteomic studies. The quality of gels obtained after 2-D electrophoresis and the opportunity of following analysis depend on protein isolation efficiency from the tissues and purification from accompanying substances. Our work is aimed on finding the most effective method of protein isolation from Pisum sativum roots inoculated with rhizobia, which might be applied for carrying the 2-D electrophoresis. Special requirements aimed at separation stages minimization important for protein stability, as well as the efficient removal of contaminants which can negatively affect the quality of separation and the subsequent evaluation of qualitative and quantitative changes in the protein synthesis are necessary for proteomics. Analysis of data revealed a number of possible methods for the protein isolation from plant tissues. A comparison of three methods of the proteins isolation using the commercial protocol from Bio-Rad; the method based on treatment with phenol and ammonium acetate as well as the trichloroacetic acid application. Pea plants of cv. Frisson were used in our work, the strain Rhizobium leguminosarum bv. viciae CIAM1026 was used for inoculation. After protein isolation from the wild-type cv. Frisson roots of pea seedlings inoculated with rhizobia (1 day after inoculation) using three methods and consequent 2-D electrophoresis, it was shown that the best results are achieved using the method with phenol following by ammonium acetate precipitation. The gels were analyzed for trace presence that made it difficult to search for different proteins, the efficiency of total protein isolation and possible degradation products. Using this selected method, the differential 2-D electrophoresis of extracted proteins was carried out with fluorescent Cy2 and Cy5 labels based on isoelectric focusing of proteins using strips with a pH range of 3-10 and subsequent separation in a polyacrylamide (PAGE) gel. The analysis showed that when proteins were isolated using phenol and ammonium acetate, it was possible to obtain rather representative proteomes of the roots of pea seedlings. The differential 2-D electrophoresis allowed to see the differences between the control samples (non-inoculated roots) and the samples inoculated with rhizobia (inoculated roots). This method may be recommended for further proteomic studies in pea roots.
Keywords: Pisum sativum L., pea, legume rhizobium symbiosis, proteomics analysis, receptors, Nod factors, legumes, rhizobia.
ФГБНУ Всероссийский НИИ сельскохозяйственной
микробиологии, |
Поступила в редакцию |
Оформление электронного оттиска
