УДК 633.11:577.114:631.52:577.2.08

ОБ ОПТИМИЗАЦИИ СИСТЕМ МОЛЕКУЛЯРНОГО МАРКИРОВАНИЯ Waxy-ГЕНОВ ПШЕНИЦЫ ДЛЯ ЦЕЛЕЙ MAS-СЕЛЕКЦИИ

М.В. КЛИМУШИНА, П.Ю. КРУПИН, М.Г. ДИВАШУК, Г.И. КАРЛОВ

В результате проведенных исследований рекомендованы два молекулярных маркера локусов Wx-А1 и Wx-В1, которые в равной степени могут быть использованы как при скрининге и поиске нуль-аллелей по указанным локусам среди разнообразия отечественных сортообразцов, так и при MAS-селекции пшеницы на пониженное содержание амилозы. С помощью отобранных маркеров созданы формы пшеницы, несущие в геноме два нуль-аллеля по локусам Wx-генов, которые способны в дальнейшем служить донорами этих аллелей при их переносе в другие сорта мягкой пшеницы.

Ключевые слова: MAS-селекция, молекулярные маркеры, Waxy-гены, мягкая пшеница.

 

У мягкой пшеницы (Triricum aestivum L.) — одной из наиболее распространенных зерновых культур в мире — к компонентам зерновки, определяющим хлебопекарные и технические свойства, относится крахмал, который представляет собой совокупность линейных (амилоза) и разветвленных (амилопектин) полисахаридов (1). Амилоза и амилопектин обычно располагаются в пластидах в виде дискретных, водонерастворимых гранул. В среднем крахмал пшеницы содержит 15-25 % амилозы и 75-86 % ами-лопектина (2), но в результате селекции выведены сорта, у которых он обогащен одним из полисахаридов. Соотношение между содержанием амилозы и амилопектина определяет различия в температуре клейстеризации, вязкости крахмального клейстера, его текстуре и способности к гелеобразованию, устойчивости к механическим воздействиям и влиянию кислой среды (3).

Ключевым ферментом в синтезе амилозы эндосперма выступает гранулосвязанная синтетаза крахмала I (GBSS I), которую кодируют гены, получившие название Waxy (4 ). Изученные Wx(Waxy) мутанты кукурузы, пшеницы, риса и ячменя были лишены GBSS I, при этом содержание амилозы у них оказалось очень низким либо она вообще не синтезировалась, а в состав крахмала входил амилопектин дикого типа (5).

В пшенице три гомеологичных генаGBSS I расположены в хромосомах 7AS (Wx-A1), 4AL (Wx-B1) и 7DS (Wx-D1) (6). Если фермент GBSS I не образуется, то считают, что пшеница имеет нуль-аллели по Waxy-ге-нам. Пшеницу с нуль-аллелями по одному или двум Wx-генам называют частично Waxy-пшеницей. Показано, что наибольшее влияние на содержание амилозы и качество зерновой продукции оказывают Wx-B1-гены, затем Wx-D1 и Wx-A1 (7). В природе полностью Waxy-пшеница не выявлена, поскольку в этом случае необходимо, чтобы спонтанно мутировали сразу три гена (7 ).

Зерно пшеницы с одним или двумя нуль-аллелями Wx-генов обладает рядом свойств, важных для производства лапши и бисквитов (8). Так, при изготовлении лапши необходим крахмал с большим объемом набухания, высоким пиком вязкости и быстрой клейстеризацией, то есть с показателями, характерными для сортов пшеницы с одним или двумя нуль-аллелями Wx-генов и пониженным содержанием амилозы. Уменьшение количества амилозы положительно влияет на хлебопекарные качества: способствует образованию пышных и хрустящих пшеничных хлопьев при производстве завтрак ов  (крахмал дикого типа вызывает ломкость и раз-мельчение продукта), положительно коррелирует с увеличением срока хранения хлебобулочных изделий, поскольку именно наличием амилозы обусловлено очерствени е хлеба (9 ).  

Зерно Waxy- пшеницы — наиболее эффективн ое сырье для получения этанола  вследствие низкой температуры клейстеризации крахмала. После разваривания при 85 °С его структура существенно нарушается, делая крахмальные цепи легкодоступными для энзимов, что снижает расход энергии и делает возможным применение Waxy-крахмала для производства биотоплива. У Waxy- пшеницы по сравнению с обычной пшеницей и кукурузой более высокая энзиматическая оценка, то есть требуется меньше времени для завершения процесса ферментации (9 ).

Таким образом, селекция сортов Waxy- и частично Waxy-пшеницы для использования в пищевой промышленности — одно из перспективных направлений, однако она затруднена наличием в геноме трех гомеологичных Waxy- генов с одинаковой функцией (5, 6 ). Кроме того, существует проблема идентификации как форм частично Waxy-пшеницы, так и локусов генов, в которых произошла мутация.

В настоящее время для выявления Waxy-мутантов применяют окрашивание гранул крахмала раствором I2-KI, RVA- анализаторы ( rapid v isco a nalyzer), например RVA-StarchMaster2 («Newport Scientific», США), а также  дифференциально- сканирующий калориметр, например DSC 204 F1 Phoenix («Netzsch», Германия), спектроскопию ближней ИК-области спек-тра , одномерный SDS-электрофорез Waxy-белков в полиакриламидном геле (SDS-PAGE), систему двумерного электрофореза (2D-PAGE) (10 ). Однако перечисленные методы либо позволяют обнаружить только полностью му-тант ные формы, либо крайне сложны, трудоемки и дороги .

Наиболее перспективным приемом для создания форм мягкой пшеницы с заданным качеством крахмала является маркер-зависимая селекция (marker assisted selection — MAS-селекция) (11). Следовательно, эффективным может считаться поиск носителей нуль-аллелей GBSS I среди сортообразцов мягкой пшеницы с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР). Мутации в трех Wx-генах изучены на молекулярном уровне, на основе чего разработаны ДНК -маркеры , позволяющие выявлять нуль-аллели Wx-генов (4, 8 ), о днако тестирование этих маркеров для задач селекции не проводилось.

Нашей целью был выбор, апробация, тестирование маркеров нуль-аллелей Waxy-генов, наиболее подходящих для MAS-селекции , поиск таких аллелей у сортообразцов сильной пшеницы  и создание форм , несущих одновременно несколько нуль-аллелей.

Методика. Использовали 40 сортов и линий озимой мягкой пшеницы (коллекция любезно предоставлена проф. В.П. Нецветаевым, Белгородский НИИ сельского хозяйства).

ДНК выделяли по методу Bernatzky и Tanksley (1986) с модифика-циями (12 ). Праймеры синтезированы в ЗАО «Синтол» (г. Москва)

Применялись следующие режимы ПЦР-амплификации:


Wx-A1, праймеры AFC и AR2 (12)

1 цикл — 95 °C, 5 мин; 32 цикла — 95 °C, 30 с;
65 °C, 30 с; 72 °C, 2 мин; 1 цикл — 72 °C, 7 мин;
хранение при 4 °C;

Wx-A1,праймерыWx-A1b-F-MH и Wx-A1b-R-MH (13)

1 цикл — 95 °C, 3 мин; 40 циклов — 94 °C, 45 с;
55 °C, 30 с; 72 °C, 1 мин; 1 цикл — 72 °C, 7 мин;
хранение при 4 °C;

Wx-A1,праймеры Sun1F и Sun1R (14)

1 цикл — 94 °C, 3 мин; 30 циклов — 94 °C, 45 с;
58 °C, 30 с; 72 °C, 1 мин; 1 цикл — 72 °C, 7 мин;
хранение при 4 °C;

Wx-B1,праймерыBDFL и BRDR (12)

1 цикл — 95 °C, 5 мин; 32 цикла — 95 °C, 30 с;
55 °C, 30 с; 72 °C, 2 мин; 1 цикл — 72 °C, 7 мин;
хранение при 4 °C;

Wx-B1,праймеры Wx-B1F и Wx-B1R (15)

1 цикл — 94 °C, 3 мин; 30 циклов — 94 °C, 60 с;
58 °C, 60 с; 72 °C, 30 с; 1 цикл — 72 °C, 7 мин;
хранение при 4 °C;

Wx-D1,праймеры Wx-D1-2-F и Wx-D1-2-R (7)

1 цикл — 95 °C, 3 мин; 40 циклов — 94 °C, 30 с;
55 °C, 45 с; 72 °C, 1 мин; 1 цикл — 72 °C, 7 мин;
хранение при 4 °C;

Wx-D1, праймеры Wx-D1-1-F и Wx-D1-1-R (16)

1 цикл — 95 °C, 3 мин; 40 циклов — 94 °C, 30 с;
55 °C, 45 с; 72 °C, 1 мин; 1 цикл — 72 °C, 7 мин;
хранение при 4 °C

Wx-D1, праймеры BDFL и DRSL (12)

1 цикл — 95 °C, 5 мин; 32 цикла — 94 °C, 30 с;
58 °C, 30 с; 72 °C, 1,5 мин; 1 цикл — 72 °C, 7 мин;
хранение при 4 °C.

Продукты ПЦР разделяли электрофорезом в 2 % агарозном геле с 0,5ÍТрис-боратным буфером ( при напряженности поля 6 В/см). В качестве маркера размеров использовали 100 bp DNA Ladder (UAB « Fermentas», Литва ).

Скрининг коллекции линий и сортов пшеницы проводили с применением оптимизированных систем молекулярного маркирования аллелей Wx-генов. Были отобраны и скрещены между собой сорта, несущие мутантные аллели по гену Waxy. Для получения расщепляющейся популяции F2 растения первого поколения самоопыляли. Гибридность растений F1 и расщепление в популяции F2 проверяли с помощью оптимизированных систем молекулярного маркирования.

Статистическую обработку данных выполняли методом c2-соответствия (13).

Результаты. К преимуществам ПЦР-метода идентификации форм Waxy- и частично Waxy-пшеницы наряду со сравнительно низкой затратностью относится возможность определять частично Waxy- образцы и выявлять аллели GBSS I, по которым произошли мутации.

На основании анализа данных литератур ы были определены молеку-лярные маркеры , которые использовались для идентификации различных аллелей GBSS I .

Г е н Waxy-A1 . Кодоминантный CAPS-маркер нуль-аллеля Wx-A1b был разработан M. Helguera с соавт. (14 ).После проведения ПЦР с соответствующим праймером размер ампликонов у нормальных аллелей и нуль-аллелей различался незначительно, и идентифицировать их можно только с помощью электрофореза в полиакриламидном геле или капиллярного электрофореза , поэтому после амплификации используется рестрикция, которая позволяет визуализировать раз личия в агарозном геле.

M.R. Shariflou с соавт. (15 ) предложили праймеры, которые представляют собой последовательности, фланкирующие микросателлитный повтор рядом с 3´ -концом сиквенса кДНК гена Waxy-А1. Благодаря высокому полиморфизму микросателлитных повторов этот маркер можно применять для идентификации аллельных вариантов гена Waxy-А1 (15 ).

Т. Nakamura с соавт. (16), используя сиквенсы мутантных и нормальных Waxy-аллелей, сконструировали кодоминантный маркер на основе праймеров, п ри использовании которых амплифицируются фрагменты со всех гомеологичных аллелей Waxy-генов, в частности для аллеля Wx-A1a дикого типа размером389 п.н., нуль-аллеля 370 п.н. (16).

А пробация и оптимизация условий ПЦР показала, что д ля скрининга и поиска нуль-аллелей в генофонде образцов мягкой пшеницы не подходит маркер, разработанный M.R. Shariflou с соавт. (15) на основе микросателлитного полиморфизма . Эта система может использоваться только при молекулярном маркировании указанного нуль-аллеля в поздних поколениях, полученных от родительских форм, у одной из которых нуль-аллель уже идентифицирован . Две другие системы подходили для скрининга целевого нуль-аллеля, о днако предложенная M. Helguera с соавт. (14) методика для идентификации аллелей требует либо проведения капиллярного электрофореза, либо использования последующей рестрикции, что, как уже отмечалось, увеличивает затраты на выполнение анализов. В связи с этим для с крининга как наиболее эффективный и надежный был выбран молекулярный маркер, предложенный Т. Nakamura с соавт. (16) .  

Г е н Waxy-В1 . A. McLauchlan с соавт. (17) разработали систему молекулярного маркирования локуса Waxy-B1: у дикого типа амплифицируются три фрагмента ДНК, у форм с нуль-аллелем — только два фрагмента (самый легкий отсутствует) . T.

Nakamura с соавт. (16) на основе сиквенсов мутантных и нормальных Waxy-аллелей сконструировали праймеры, с которыми фрагменты ам плифици ровались со всех гомеологичных аллелей Waxy-генов, при этом у дикого типа Wx-B1a образовывались ампликоны длиной425 п.н., а в случае нуль-аллеля Wx-B1b амплификация отсутствовала .

В наших опытах при оптимальных условиях ПЦР в первой из указанных систем в части проб  наблюдалась нетипичная амплификация, что могло затруднить интерпретацию результатов при скрининге образцов пшеницы из коллекции. В связи с этим для скрининга по гену Wx-В1 мы использовали молекулярный маркер, предложенный T. Nakamura с соавт. (16) , как наиболее надежный.

Г е н Waxy-D1 . M.R. Shariflou с соавт. (7) использовали праймеры, позволяющие в случае нуль-аллеля по Waxy-D1 амплифицировать фрагмент размером 279 п.н., аллеля дикого типа 910 п.н.

P. Vrinten с соавт. (18) после р азделения продуктов амплификации в 3 % агарозном геле с окрашиванием бромистым этидием у нуль-аллелей по Waxy-D1 получали фрагмент меньшего размера , чем в случае дикого типа.

T. Nakamura с соавт. (16) на основании сиквенсов мутантных и нормальных Waxy-аллелей разработали кодоминантный маркер аллелей Waxy- D1(при наличии нуль-аллеля амплифицируется фрагмент размером 1731 п.н., в случае дикого типа 2307 п.н.).

Во второй и третьей системах мы амплификацию не наблюдали . В целом это согласуется с данными их авторов, которые отмечали, что указанные маркеры эффективны только на растительном материале и с аллелями, используемыми ими в селекционных программах и научных исследованиях. Таким образом, единственным подходящим для использования при скрининге нашей коллекции по гену Wx-D1 был молекулярный маркер, разработанный M.R. Shariflou с соавт . (15).

П о и с к  н о с и т е л е й  н у л ь - а л л е л е й  с р е д и   о б р а з-
ц о в   и   п о л у ч е н и е  г и б р и д о в. Из 40 сортов мягкой пшеницы при скрининге с выбранными нами праймерами только два образца (сорта Старшина и Коротышка) несли нуль-аллели соответственно по локусам Wx-А1 и Wx-В1 . В исследуемой коллекции форм с нуль- аллелем по гену Wx-D1 не обнаружили (у всех сортов имелся локус дикого типа). Следует отметить, что нуль-аллель гена Wx-D1 крайне редко встречается у образцов мягкой пшеницы.

А

Б

Электрофореграмма продуктов амплификации молекулярных маркеров Wx-В1(А) и Wx-А1 (Б) в расщепляющейся популяции F2: 1, 3, 4, 6, 7, 8 — растения, гетерозиготные или гомозиготные по аллелю дикого типа Wx-В1; 2, 5 — растения, гомозиготные по нуль-аллелю Wx-В1; 9 — растения, гетерозиготные поWx-А1; 10 — растения, несущие аллель дикого типа Wx-А1;11 — растения, несущие гомозиготный нуль-аллель Wx-А1. М — маркер молекулярных масс (100 bp DNA Ladder, UAB «Fermentas», Литва).

При скрещивании в комбинации сорт Старшина x сорт Коротышка г ибридность растений F1 по локусам Wx-А1 и Wx1 подтвердили с помощью молекулярных маркеров .Полученные в результате самоопыления гибридов F1 203 растения F2 также проанализировали на наличие локусов нуль-аллелей по Wx-генам (рис., А). Строго говоря, молекулярный маркер Wx-В1 не является кодоминантным, так как не позволяет определить гетерозиготные растения. Но поскольку регистрируется амплификация с других Wx-генов, можно достоверно утверждать, что и в случае нуль-аллеля выделение ДНК и ПЦР прошли корректно . Предполагаемое расщепление составило 3 (1 гомозигота дикого типа и 2 гетерозиготы):1 (гомозигота нуль-аллеля), ф актическое 159 : 47, или 3,38:1. Фактическое значение c2 равнялось 0,524, табличное 3,841.

Поскольку основной целью анализа расщепляющейся популяции F2 было выявление форм с двойными нуль-аллелями по Waxy- генам, с маркером для Wx-А1 анализировали только растения с подтвержденной гомозиготностью по нуль-аллелю Wx-В1. После оптимизации условий электрофореза (4 % агарозный гель, 3 В/см) амплифицированные фрагменты удалось разделить на три фракции ( у авторов методики этих фракций две) (16 ), что в расщепляющейся популяции позволяет обнаруживать как гомозиготы, так и гетерозиготы (см. рис., Б ). При использовании этих молекулярных маркеров в популяции F2 из 206 проанализированных растений мы отобрали 10 с двойными нуль- аллелями по Wx-генам.

Итак, выявлены два молекулярных маркера локусов Wx-А1 и Wx1 у пшеницы,которые в равной степени подходят для скрининга носителей соответствующих нуль-аллелей среди сортообразцов и использования при MAS-селекции (marker assisted selection селекции с применением молекулярных маркеров) на пониженное содержание амилозы. С помощью этих маркеров мы получили формы пшеницы, которые несут в геноме два нуль-аллеля по локусам Wx-генов и в дальнейшем могут служить донорами этих аллелей при скрещиваниях с другими сортами мягкой пшеницы.  

 

Л И Т Е Р А Т У Р А

1. G a o  M.,  F i s h e r  D.K.,  K i m  K-N.,  S h a n n o n  J.C.,  G u i l t i n a n  M.J. Evolutionary conservation and expression patterns of maize starch branching enzyme I and IIb genes suggests isoform specialization. Plant Mol. Biol., 1996, 30: 1223-1232.
2. G u a n  H.,  K e e l i n g  P.L. Starch biosynthesis: u nderstanding the f unctions and i nteractions of m ultiple i sozymes of s tarch s ynthase and b ranching e nzyme. Trends GlycoSci. Glycotech., 1998, 110: 307- 319.
3. H e m e r y  Y.,  R o u a u  X.,  L u l l i e n - P e l l e r i n  V.,  B a r r o n  C.,  A b é c a s-
s i s  J. Dry processes to develop wheat fractions and products with enhanced nutritional quality. J. Cereal Sci .,  2007, 46: 327-347.
4. T a k a t a  K.,  Y a n a k a  M.,  F u j i t a  Y.,  I s h i k a w a  N. Evaluation of the grain and flour quality in near-isogenic wheat lines with Waxy and double-null Wx proteins. Breeding Sci ., 2007, 57: 79-83.
5. S h u r e  M.,  W e s s l e r  S.,   F e d o r o f f  N. Molecular identification and isolation of waxy locus in maize. Cell , 1983, 35: 225- 233.
6. S t o d d a r d  F.L. Survey of starch particle-size distribution in wheat and related species. Cereal Chem., 1999, 76: 145-149.
7. S h a r i f l o u  M.R.,  H a s s a n i  M.E.,  S h a r p  P.J. A PCR-based DNA marker for detection of mutant and normal alleles of the Wx-D1 gene of wheat. Plant Breed ., 2001, 120(2): 121-124.
8. Y a s u i  T.,  M a t s u k i  J.,  S a s a k i  T.,   Y a m a m o r i  M. Amilose and lipid contents, amilopectin structure, and gelatinisation properties of waxy wheat starch. J. Cereal Sci., 1996, 24: 131-137.
9. Z h a o  X.C.,  S h a r p  P.J.,  C r o s b i e  G.,  B a r c l a y  I.,  W i l s o n  R.,  M o r e l l  M.K.,
A p p e l s  R. A single genetic locus associated with starch granule properties in a cross between wheat c ultivars of disparate noodle quality. J. Cereal Sci., 1998, 27: 7- 13.
10. T a k e s h i  Y. Waxy and low- amylose mutants of bread wheat (Triticum aestivum L.) and their starch, flour and grain properties. JARQ, 2006, 40: 327-331.
11. Х а к и м о в а  А.Г.,  М и т р о ф а н о в а  О.П. Пуроиндолины в связи с перспективами селекции мягкой пшеницы на качество и устойчивость (обзор иностранной литературы). С.-х. биол., 2009, 1: 3-15.
12. B e r n a t z k y  R.,  T a n k s l e y  S.D. Toward a saturated linkage map in tomato based on isozyme and random cDNA sequences. Genetics, 1986, 112: 887 -898.
13. С м и р я е в  А.В.,  К и л ь ч е в с к и й  А.В. Генетика популяций и количественных признаков. М., 2007: 220-222.
14. http://maswheat.ucdavis.edu/Achievements/papers2008.htm
15. S h a r i f l o u  M. R.,  S h a r p  P. J. A polymorphic microsatellite in the 3' end of « waxy» genes of wheat, Triticum aestivum.  Plant Breed., 1999, 118(3): 275-277.
16. N a k a m u r a  T.,  V r i n t e n  P.,  S a i t o  M.,  K o n d a  M.  Rapid classification of partial waxy wheats using PCR-based markers. Genome, 2002, 45: 1150-1156.
17. M c L a u c h l a n  A.,  O g b o n n a y a  F.C.,  H o l l i n g s w o r t h  B.,  C a r t e r  M., G a l e  K.R.,  H e n r y  R.J.,  H o l t o n  T.A.,  M o r e l l  M.K.,  R a m p l i n g  L.R.,
S h a r p  P.J.,  S h a r i f l o u  M.R.,  J o n e s  M.G.K.,  A p p e l s  R. Development of robust PCR-based DNA markers for each homoeoallele of granule-bond starch synthase and their application in wheat breeding programs. Aust. J. Agric. Res., 2001, 52: 1409-1416.
18V r i n t e n  P.,  N a k a m u r a  T.,  Y a m a m o r i  M. Molecular characterization of waxy mutations in wheat . Mol. Gen. Genet ., 1999, 261: 463-471.

 

ABOUT OPTIMIZATION OF MOLECULAR LABELING OF WHEAT Waxy-GENES FOR MAS-SELECTION

M.V. Klimushina, P.Yu. Kroupin, M.G. Divashuk, G.I. Karlov

The results of the investigations show that the two molecular markers for Wx-A1 and Wx-B1 loci can be recommended for marker-assisted selection of wheat. They have been found to be suitable both for searching for the null-alleles among the variety of Russian cultivars and for MAS-selection for reduction of amylase content in grain. Using the selected markers the authors have developed the wheat lines containing two null-alleles of Wx-genes, which can be applied as donors to transfer these alleles to other wheat cultivars.

Key words: marker-assisted selection, molecular markers, Waxy-genes, bread wheat.

Центр молекулярной биотехнологии,
Российский государственный аграрный
университет—МСХА им. К.А. Тимирязева,

127550 г. Москва, ул. Тимирязевская, 49,
e-mail: karlov@timacad.ru

Поступила в редакцию
29 апреля 2010 года

 

Оформление электронного оттиска

назад в начало