УДК 633.1:581.33:58.02:57.086.83

ЦИТОЛОГИЧЕСКОЕ ПОДТВЕРЖДЕНИЕ СПОРОФИТНОГО РАЗВИТИЯ МИКРОСПОР В КУЛЬТУРЕ ПЫЛЬНИКОВ ТРИТИКАЛЕ БЕЗ ХОЛОДОВОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ

Т.И. ДЬЯЧУК, О.В. ХОМЯКОВА, Т.О. ДУГИНА

В культуре пыльников, полученных от донорных растений гекса- и октаплоидных тритикале и сорта Студент, цитологическими методами изучали развитие микроспор без воздействия на пыльники холодовым шоком. Выявлено отсутствие необходимости индуцировать андрогенез шоковыми температурами.

Ключевые слова: тритикале, культура пыльников, спорофитное развитие, предобработка холодом.

 

Культура пыльников — один из приемов массового получения гаплоидных растений злаков. Этот метод основан на формировании копий зиготических зародышей (эмбриоидов) из микроспор — андрогенезе (гаплоидный эмбриогенез, пыльцевой эмбриогенез, андроклиния), который наступает, когда пыльники растений, изолированные на определенной стадии развития, культивируются на питательных средах с гормональными добавками. Гомозиготные линии, полученные на основе диплоидизированных гаплоидов, нашли широкое применение при создании сортов и исходного селекционного материала яровой и озимой мягкой пшеницы, ячменя, риса и тритикале (1).

В многочисленных экспериментах продемонстрирована возможность индукции спорофитного развития микроспор донорных растений при воздействии на колосья и пыльники. Для увеличения его частоты большое распространение получило применение пониженной положительной температуры. Фактически холодовое воздействие стало рутинной процедурой при создании гаплоидов в мировой практике. Высказываются различные мнения о влиянии предобработки пыльников холодом на дальнейшее спорофитное развитие при культивировании. Физиологические исследования показали, что предобработка холодом снижает интенсивность дыхания пыльников и продлевает их жизнеспособность (2). Есть мнение, что холодовые обработки вызывают реориентацию веретена I деления, в результате чего возникают микроспоры с двумя равными ядрами (3). При низких температурах задерживается деструкция стенки пыльника, оказывающая вредное влияние на развитие изолированных микроспор в культуре (цит. по 4), но продлевается жизнеспособность микроспор и период, пригодный для введения пыльников в культуру in vitro («эмбриогенное окно»). Это обстоятельство играет существенную роль в случаях, когда требуется время для доставки материала от донорных растений в лаборатории. Эффекту холода приписывается либо выключение генов, либо ингибирование функции генных продуктов, ответственных за гаметофитную программу (5). Считается также, что в культуре in vitro триггером спорофитного развития микроспор, находящихся в критической сильновакуолизированной стадии, служит стрессовое воздействие холодом в определенном режиме (6).

В то же время обнаружена неоднозначность влияния этого фактора на культивируемые пыльники злаков. Так, пыльники пшеницы, взятые из донорных растений, выращенных в поле, не требовали воздействия холодом для индукции делений в микроспорах. Наблюдался неоднозначный эффект холодового воздействия в течение различных сезонов (7). Предобработка срезанных колосьев ячменя холодом (от 3 до 14 сут) не дала положительных результатов в культуре пыльников ячменя (8). В опытах с двумя широко возделываемыми сортами пшеницы Acheloos и Vergina и гибридами от их скрещивания друг с другом показано отсутствие необходимости холодовых предобработок для гаплопродукции в культуре пыльников: основную роль играл генотип донорного растения и температура культивирования пыльников (9).

Изучение холодового воздействия на генотипах мягкой пшеницы саратовской селекции с разной степенью отзывчивости выявило, что спорофитное развитие микроспор происходит и в пыльниках свежеубранных колосьев, причем у некоторых генотипов с большей частотой по сравнению с таковой у пыльников, подвергающихся этому стрессу (1, 10).

Нашей целью было цитологическое исследование спорофитного развития микроспор в свежеубранных пыльниках, не подвергавшихся холодовому воздействию.

Методика. Объектом изучения служили выращенные в полевых условиях (Саратовская обл., 2006-2008 годы) донорные растения первичных гекса- и октаплоидных тритикале, полученных с использованием сортов озимой ржи саратовской селекции, и допущенного к использованию в Саратовской области сорта Студент. Свежеубранные колосья, пыльники которых содержали вакуолизированные микроспоры, стерилизовали по стандартным процедурам и культивировали на питательной среде N 6 с добавлением в качестве регуляторов роста 2,4-Д (1,5 мг/л) и кинетина (0,5 мг/л); концентрация сахарозы — 6 %. Через 4; 9; 14 и 21 сут после начала культивирования пыльники фиксировали в растворе Карнуа (3:1) (по 50 шт. для каждого срока), окрашивали ацетокармином и готовили давленые препараты по общепринятым цитологическим методикам (11). Цитологические исследования с последующей микрофотосъемкой выполняли на микроскопе IM35 («Opton», Германия).

Данные обрабатывали методом дисперсинного анализа с помощью программы Agros.

Результаты. Цитологические исследования выявили возможность различных событий при культивировании свежеубранных пыльников: основная часть микроспор погибала уже к 7-м сут культивирования, часть микроспор продолжала развиваться по гаметофитной программе с дальнейшей дегенерацией продуктов деления, и лишь немногочисленная популяция клеток переходила к спорофитному развитию. Последнее проявлялось как равное деление микроспоры (расположение поры и двух образующихся ядер соответствовало равностороннему треугольнику) (рис., 1) либо деление с формированием вегетативной и генеративной клеток (при последующей митотической активности вегетативной клетки) (см. рис., 2). В результате серии делений формировались многоклеточные структуры, которые находились внутри оболочки микроспоры (см рис., 3-6). Интенсивный рост многоклеточных новообразований вызывал растяжение и разрыв оболочки микроспоры, а затем и стенки пыльника (см. рис., 7-9). Анализ частоты образования различных андрогенетических структур (эмбриоидов и каллусов) свидетельствует, что для индукции андрогенеза в культуре пыльников тритикале не требовалось воздействия шоковыми температурами. Более того, у двух генотипов (амфидиплоид АД-1 и сорт-стандарт Студент) спорофитное развитие микроспор происходило только в пыльниках свежеубраных колосьев, не подвергавшихся хранению при пониженных положительных температурах (частота соответственно 1,7 и 7,8 %) (табл.).

Таким образом, наблюдения за цитологическими событиями в культуре пыльников тритикале без воздействия холодовым шоком выявили различные стадии спорофитного развития микроспор, описанные ранее для пыльников, подвергающихся воздействию этого стресса (3, 12).

Цитологические события при спорофитном развитии микроспор в культуре пыльников тритикале без холодового шока (состав среды культивирования см. в разделе «Методика»): а, б — первые деления микроспор; в-д — формирование многоклеточных новообразований; е — общий вид пыльника; ж-и — разрыв оболочки микроспоры; к, л — формирование андрогенетических объектов (каллусов и эмбриоидов); м — общий вид пыльника с андрогенетическими структурами; а-и — окрашивание ацетокармином; увеличение ½10½60.

Считается, что генеральным сигналом, ответственным за переключение микроспор на альтернативное, то есть спорофитное, развитие, служит стресс (13). В культуре пыльников ячменя (14), риса (15), пшеницы (16, 17) роль такого стресса может выполнять азотное или углеводное голодание пыльников, в культуре пыльников (18) и изолированных микроспор пшеницы (13) — температура (свыше 30 °С).

Частота спорофитного развития микроспор в культуре пыльников у разных генотипов тритикале при воздействии и без воздействия холодом

Генотип

Число пыльников, шт.

Частота эмбриогенных пыльников, %

Общая частота новообразований, %

АД-1:

 

 

 

опыт

235

0,85

1,70

контроль

456

0

0

АД-2:

 

 

 

опыт

1871

1,12

1,34

контроль

4690

0,38

0,41

АД-3:

 

 

 

опыт

240

2,92

2,92

контроль

507

0,99

0,99

Сорт Студент (стандарт):

 

 

опыт

51

3,92

7,80

контроль

326

0

0

НСР05

 

0,08

0,09

П р и м е ч а н и е. Состав среды культивирования см. в разделе «Методика». Опыт — без холодового шока, контроль — при холоовом воздействии.

Полученные нами результаты по культивированию пыльников тритикале и пшеницы не подтверждают точку зрения о роли пониженных положительных температур как триг-гера спорофитного развития мик-роспор (6). Очевидно, само удаление колосьев с донорного растения является стрессом, который в сочетании с культивированием пыльников в условиях in vitro без других воздействий может вызывать репрессию гаметофитных генов и переключение на программыу спорофитного развития.

Итак, анализ частоты образования андрогенетических структур (каллусов и эмбриоидов) свидетельствует, что для индукции андрогенеза в культуре пыльников тритикале не требуется воздействия шоковыми температурами. Следовательно, существующая процедура культивирования пыльников может быть упрощена за счет исключения одного из этапов — предварительного выдерживания пыльников при пониженных положительных температурах.

Л И Т Е Р А Т У Р А

1. Д ь я ч у к  Т.И. Технологические и селекционные аспекты гаплоидии (на примере пшеницы и ячменя). Докт. дис. Саратов, 2003.
2. O u y an g  J.W.,  H e  D.G.,  F e n g  G.H.,  J i a  S.E. The response of anther culture to culture temperature varies with growth conditions of anther-donor plants. Plant Sci., 1987, 49: 145-148.
3. С у х а н ов  В.М. Андроклиния и ее особенности у пшеницы. Канд. дис. Саратов, 1983.
4. Р е з н и к о в а  С.А. Цитология и физиология развивающегося пыльника. М., 1984.
5. C h e n  Y. Anther and pollen culture of rice. In: Haploids in higher plants in vitro. Springer Verlag Publishers, 1986: 3-25.
6. К р у г л о в а  Н.Н.,  Б а т ы г и н а  Т.Б.,  Г о р б у н о в а  В.Ю.,  С е л ь д и м и р о в а  О.А. Эмбриологические основы андроклинии пшеницы: атлас. М., 2005.
7. H e n r y  Y.,  d e  B u y s e r  J. Wheat anther culture. In: Biotechnology in agriculture and forestry (Wheat) /Y.P.S. Bajaj (ed.). Springer-Verlag, 1990: 283-326.
8. А л е к с а н д р о в а  Л.Г.,  Л у к ь я н ю к  С.Ф. Пыльниковая культура ячменя: эффективность, воспроизводимость. Мат. науч. конф. по с.-х. биотехнологии. Целиноград, 1991: 63-65.
9. X y n i a s  I.N.,  Z a m a n i  I.A.,  G o u l - V a v d i n o u d i  E. Effect of cold pretreatment and incubation temperature on bread wheat (Triticum aestivum L.) anther culture. Cer. Res. Com., 2001, 29: 331-338.
10. Т к а ч е н к о  О.В. Культура тканей in vitro коротстебельной мягкой и твердой пшеницы. Автореф. канд. дис. Саратов, 2001.
11. П а у ш е в а  З.П. Практикум по цитологии растений. М., 1970.
12. А н а п и я е в  Б.Б. Экспериментальный морфогенез и биотехнология получения гаплоидов в культуре микроспор пшеницы. Автореф. докт. дис. М., 2001.
13. T o u r a e v  A.,  I n d r i a n t o  A.,  W r a t c h k o  I.,  H e b e r l e - B o r s  E. Efficient microspore embryogenesis in wheat (Triticum aestivum L.) induced by starvation at high temperature. Sex Plant Reprod., 1996, 9: 209-215.
14. H o e k s t r a  S.,  Z i j d e r v e l d  M.H.,  H e i d e k a m p  F.,  M a r k  F. Microspore culture of Hordeum vulgare L.: the influence of dencity and osmolality. Plant Cell Reprod., 1993, 12: 661-665.
15. O g a w a  T.,  F u k u o k a  H.,  O h k a w a  Y. Induction of cell division of isolated pollen grains by sugar starvation in rice. Breed. Sci. Jpn., 1994, 44: 75-77.
16. H u  T.C.,  Z i a u d d i n  A.,  S i m i o n  E.,  K a s h a  K.J. Isolated microspore culture of wheat (Triticum aestivum L.) in a defined media. 1. Effects of pretreatments, isolation methods and hormones. In vitro Cell Dev. Biol. (Plant), 1995, 31: 79-83.
17. M e j z a  S.J.,  M o r g a n t  V.,  D i  B o n a  D.,  W o n g  I.R. Plant regeneration from isolated microspores of Triticum aestivum L. Plant Cell Rep., 1993, 12: 149-153.
18. H u a n g  B. Wheat anther culture: effect of temperature. In: Biotechnology in agriculture and forestry (Wheat). V. 13 /Y.P.S. Bajaj (ed.). Springer-Verlag, 1990: 403-415.
19. L i  H.C.,  Q u r e s h h i  J.,  K a r t h a  K.K. The influence of different temperature treatments on anther culture response of spring wheat (Triticum aestivum L.). Plant Sci., 1988, 57: 55-61.

 

CYTOLOGICAL EVIDENCE OF SPOROPHYTE DEVELOPMENT OF MICROSPORES IN CULTURE OF TRITICALE ANTHERS WITHOUT COLD TREATMENT

T.I. D’yachuk, O.V. Khomyakova, T.O. Dugina

In the culture of anthers, obtained from donor hexa- and octoploid triticale plants and the Students variety, by the cytological techniques the authors studied the development of microspores without action on anthers by cold shock. It was revealed, that shock temperatures are not required for an induction of androgenesis.

Key words: triticale, anther culture, sporophytic development, cold pretreatment.

ГНУ НИИ сельского хозяйства
Юго-Востока Россельхозакадемии,

410010 г. Саратов, ул. Тулайкова, 7,
e-mail: raiser_saratov@mail.ru, cell_selection@list.ru

Поступила в редакцию
11 марта 2009 года

 

Оформление электронного оттиска

назад в начало