УДК 633.111«321»:577.2

ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ РАСТЕНИЙ-РЕГЕНЕРАНТОВ МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ С ПОМОЩЬЮ IRAP-МАРКЕРОВ

Л.Ф. СОЗИНОВА, И.Л. ЦВЕТКОВ, А.И. СЕЙТБАТТАЛОВА, А.Б. КОМАРОВ, В.И. ГЛАЗКО, Е.М. РАМАНКУЛОВ, А.К. САДАНОВ

Проводили генетическую дифференциацию сомаклонов яровой мягкой пшеницы с использованием IRAP-маркеров. Сочетание двух типов праймеров в полимеразной цепной реакции позволило оценить уровень полиморфизма у растений-регенерантов и выявить их отличия от исходных форм по генетической структуре.

Ключевые слова: молекулярно-генетические маркеры, полиморфизм, ПЦР, ДНК-маркеры.

 

Молекулярно-генетические маркеры применяют в селекции растений в течение достаточно длительного времени для идентификации генов, ответственных за желательные фенотипические признаки, при разработке программ скрещивания и т.д. (1, 2). За последние 30 лет были выявлены и использовались несколько поколений таких маркеров — от электрофоретических вариантов белков, отражающих полиморфизм соответствующих структурных генов, до высокополиморфных «анонимных» последовательностей ДНК, фланкированных инвертированными повторами декануклеотидов (RAPD-PCR — random amplified polymorphic DNA), микросателлитных локусов (ISSR-PCR — inter-simple sequence repeat). Прямое генотипирование по полиморфизму нуклеотидных последовательностей стало возможным благодаря методам, основанным на полимеразной цепной реакции (ПЦР — PCR). Накопленные данные о мобильных генетических элементах в геномах животных и растений позволили разработать способы оценки полиморфизма участков ДНК, фланкированных инвертированными повторами, в частности, терминальных участков ретротранспозонов. Одно из достоинств этих методов — возможность генотипирования одновременно по многим локусам, локализованным в разных участках генома, что особенно важно при микроклональном размножении растений in vitro.

В Национальном центре биотехнологии Республики Казахстан (НЦБ РК) при получении новых форм мягкой пшеницы, устойчивых к абиотическим и биотическим стрессам, у сомаклонов, полученных методом культуры тканей на селективных средах, выявили значительную вариабельность фенотипических и цитогенетических признаков. Такие изменения могут сохраняться в ряде поколений и использоваться для отбора новых перспективных форм, обладающих качествами, которые отсутствовали или были менее выражены у родительских сортов. Это представляет несомненный интерес для селекционеров и требует создания удобных и простых методов контроля генетической структуры сомаклонов.
Ранее мы разработали протокол ПЦР с использованием IRAP-маркеров (inter-retrotransposon amplified polymorphism) полиморфизма фрагментов ДНК, фланкированных инвертированными повторами терминальных участков ретротранспозонов, и подобрали наиболее эффективные одиночные праймеры для тестирования генотипов мягкой пшеницы (3).

В задачу настоящего исследования входила оценка эффективности использования IRAP-маркеров в анализе генетической дифференциации сомаклонов яровой мягкой пшеницы и оптимизация протокола ПЦР, в связи с чем изучали возможность сочетания в одной реакции двух типов праймеров.

Методика. Анализировали две исходные формы растений яровой мягкой пшеницы (сорт саратовской селекции Л 503 и линию Л 118/95-1 из питомника конкурсного сортоиспытания Научно-производственного центра зернового хозяйства им. А.И. Бараева, Республика Казахстан) и третье поколение регенерантов, полученных методом культуры зародышей на селективных питательных средах с последующим размножением в полевых условиях.

Регенерант № 21 (20 % КФ F.g.) сорта Л 503 получили из устойчивой каллусной линии при микроклонировании на среде Мурасиге и Скуга (МС) с добавлением 20 % культурального фильтрата (КФ) штамма F3 гриба Fusariumgraminearum,депонированного в Республиканской коллекции микроорганиз-мов Республики Казахстан (свидетельство о депонировании ? 169 от 29.12.2004 г.), № 6 (0,5 % NaCl) линии Л 118/95-1 — в процессе селекции каллусных тканей на среде МС с добавлением 0,5 % NaCl, № 10 (30 % КФ F.g.) линии Л 118/95-1 — из устойчивого каллуса, культивируемого на среде МС с добавлением 30 % КФ штамма F3 F. graminearum в процессе селекции на повышенную устойчивость к фузариозной корневой гнили. Для сравнения межсортовых различий в анализ были включены семена сорта Диас 2.

При выделении ДНК использовали набор «Diatom DNA Prep 100» (ООО «Биоком», Россия). Методика выделения основана на сорбции преимущественно высокомолекулярной фракции нуклеиновых кислот на частицах сорбента, что позволяет получить ДНК высокого качества с минимальными потерями без использования фенола и хлороформа (процедура выделения занимала около 2 ч). Семена пшеницы проращивали в течение 5 сут. Проростки гомогенизировали в лизирующем буфере набора. К образцу добавляли кремниевый сорбент, входящий в набор «Diatom DNA Prep 100», проводили 3-кратную промывку солевым буфером. После удаления буфера осадок подсушивали в течение 10 мин при температуре 65 °С и растворяли в 75 мкл экстрагирующего раствора. Образец термостатировали в течение 10 мин при 65 °С, центрифугировали 10 мин при 10 тыс. об/мин, затем отбирали супернатант, содержащий ДНК. Для контроля выделенной ДНК проводили электрофорез в 0,8 % агарозном геле.

В работе использовали следующие праймеры к умеренно повторяющимся последовательностям семейства R173 (4):

PawS 5

5′-AAСGAGGGGTTCGAGGCC-3′

PawS 6

5′-GAGTGTCAAACCCAACGA-3′

PawS 16

5′-ACCTCTGCGCTTGGAGGC-3′

PawS 17

5′-CTACACGGACTGGGTCCG-3′

Для проведения адресной амплификации геномной ДНК использовали две комбинации праймеров: PawS 5 + PawS 16 и PawS 6 + PawS 17.
Температуру отжига для праймеров подбирали в компьютерной программе OLIGO 6. Реакцию проводили на амплификаторе фирмы «Biosan» (Латвия) в течение 3 ч. Для амплификации использовали лиофильно высушенную реакционную смесь производства «Биоком» (Россия), содержащую трифосфатные нуклеотиды, Tag-ДНК-полимеразу, стабилизатор полимеразы. К сухой смеси добавляли раствор геномной ДНК (10 мкл) и праймеры (20 пмоль). В каждой пробирке на реакционную смесь наслаивали по две капли минерального масла. Контролем служил образец, в который вместо исследуемой ДНК вносили экстрагирующий раствор. Амплификацию проводили в следующем режиме: 3 мин при 94 °С; далее 40 циклов: 1 мин при 94 °С, по 1 мин при 54 °С (для первой пары праймеров) и 48 °С (для второй пары), 1 мин при 72 °С; конечная элонгация в течение 4 мин при 72 °С. На следующем этапе выполняли электрофоретическое разделение продуктов амплификации в 1,5 % агарозном геле с 1?ТБЕ-буфером при 120 Вт в течение 2 ч, длина пробега 13-15 см. Готовый гель окрашивали бромистым этидием, фрагменты ДНК анализировали в трансиллюминаторе «Geldoc» («Bio-Rad», США).

Каждый фрагмент ДНК рассматривали как отдельный локус с доминантным типом наследования; отсутствие продукта амплификации учитывали как гомозиготу по рецессивному признаку.

Результаты. У растений-регенерантов суммарный спектр продуктов амплификации (ампликонов) участков ДНК, фланкированных инвертированным повтором праймеров PawS 6 + PawS 17, состоял из 21 фрагмента длиной от 100 до 2500 п.н., в варианте PawS 5 + PawS 16 — из 24 фрагментов длиной от 100 до 2500 п.н. (рис.). Вторая комбинация праймеров позволила выявить больше полиморфных локусов, чем первая, были обнаружены отличия генотипов исследованных растений-регенерантов от исходных форм, установлены индивидуальные особенности линий по сочетанию ряда ампликонов.

Глазко.jpg

Электрофореграммы продуктов амплификации IRAP-маркеров ДНК сортов (3, 8, 9, 14), линии (5, 11) и растений-регенератов (4, 6, 7, 10, 12, 13) яровой мягкой пшеницы, полученных с использованием комбинаций праймеров PawS 6 + PawS 17 (2-8) и PawS 5 + PawS 16 (9-15): 1 — маркер молекулярной массы (Gene Ruler 1 kb DNA Ladder, фрагменты 250-3500 п.н.); 2 — отрицательный контроль для PawS 6 + PawS 17; 3 — Л 503; 4 — № 21 Л 503 (20 % КФ F.g.); 5 — Л 118/95-1; 6 — № 6 Л 118/95-1 (0,5 % NaCl); 7 — № 10 Л 118/95-1 (30 % КФ F.g.); 8 — Диас 2; 9 — Л 503; 10 — № 21 Л 503 (20 % F.g.); 11 — Л 118/95-1; 12 — № 6 Л 118/95-1 (0,5 % NaCl); 13 — № 10 Л 118/95-1 (30 % КФ F.g.); 14 — Диас 2; 15 — отрицательный контроль для PawS 5 + PawS 16. Описание сортов, линии и регенерантов (третье поколение) см. в разделе «Методика».

В работе по генетической дифференциации сортов риса с помощью IRAP-маркеров ра-нее также использовались сочетания праймеров PawS (5). В отличие от мягкой пшеницы у образцов риса получено заметно меньше ампликонов — до 7 на один сорт, их размеры варьировали от 400 до 1900 п.н. У сортов картофеля с комбинацией праймеров PawS 5 + PawS 16 получили от 1 до 3 ампликонов, однако использование для амплификации отдельных праймеров привело к увеличению числа выявляемых локусов (6, 7).

В наших исследованиях с сортами яровой мягкой пшеницы сочетание праймеров PawS 6 + PawS 17 позволило выявить от 8 до 14, PawS 5 + PawS 16 — от 7 до 16 ампликонов.

В спектрах продуктов амплификации всех сортов и линий при использовании обеих комбинаций праймеров были обнаружены сходные ампликоны длиной 150, 200 и 800 п.н. Исходные формы и сорт Диас 2 отличались друг от друга по набору продуктов амплификации с одними и теми же праймерами; наиболее сложный спектр выявили у гибридной формы Л 118/95-1 (30 % КФ F.g.).

Регенерант № 21 (20 % КФ F.g.) сорта Л 503 отличался от родительской линии Л 503 по четырем локусам, регенеранты № 6 (0,5 % NaCl) линии Л 118/95-1 и № 10 (30 % КФ F.g.) линии Л 118/95-1 отличались от исходной формы по 12 локусам, друг от друга — по 7. В спектрах ампликонов у всех исследованных растений-регенерантов выявили индивидуальные особенности, связанные с присутствием/отсутствием отдельных фрагментов ДНК. Была обнаружена изменчивость по полилокусным спектрам у линий, полученных на разных селективных средах. Эти различия свидетельствуют о сложности процессов возникновения генетической изменчивости, происходящих в клетках при каллусообразовании, морфогенезе, регенерации растений.

Таким образом, IRAP-маркеры можно применять для генетической дифференциации сомаклонов яровой мягкой пшеницы. Использование в полимеразной цепной реакции комбинаций праймеров PawS 5 + PawS 16 и PawS 6 + PawS 17 позволяет выявить фрагменты ДНК, фланкированные инвертированными повторами терминальных участков ретротранспозонов, и установить индивидуальные особенности каждой линии растений-реге-нерантов. Добавление в среду культивирования селективных факторов приводит к изменению направления селекции и способствует фиксации генотипов, отличных от исходных форм.

Л И Т Е Р А Т У Р А

1. S c h u l m a n  A.H. Molecular markers to assess genetic diversity. Euphytica, 2007, 158(3): 313-321.
2. Х а р ч е н к о  П.Н.,  Г л а з к о  В.И. ДНК технологии в развитии агробиологии. М., 2006.
3. С о з и н о в а  Л.Ф.,  Ц в е т к о в  И.Л.,  К о м а р о в  А.Б. и др. Разработка протокола генетической дифференциации сортов пшеницы с использованием нового класса молекулярно-генетических маркеров. Биотехнология. Теория и практика, 2007, 3: 24-31.
4. R o g o w s k y  P.M.,  M a n n i n g  S.,  L i u  J.-Y. е.а. The R173 family of rye-specific repetitive DNA sequences: a structural analysis. Genome, 1991, 34: 88-95.
5. Ц в е т к о в  И.А.,  И в а н о в  А.Н.,  Г л а з к о  В.И. Генетическая дифференциация сортов риса по IRAP-маркерам. Изв. ТСХА, 2006, 4: 155-159.
6. З а й ц е в  В.С.,  Х а в к и н  Э.Е. Идентификация генотипов растений с помощью ПЦР-анализа рассеянных повторяющихся последовательностей R173. Докл. РАСХН, 2001, 2: 3-5.
7. Б и р ю к о в а  В.А. Оценка генетического разнообразия сортов картофеля и родственных видов Solanum методом анализа умеренно повторяющихся последовательностей генома. Канд. дис. М., 2006.

 

GENETIC DIFFERENTIATION OF SOFT WHEAT REGENERANTS USING IRAP-MARKERS

L.F. Sozinova, I.L. Tsvetkov, A.I. Seitbattalova, A.B. Komarov, V.I. Glazko, E.M. Ramankulov, A.K. Sadanov

Genetic differentiation of soft wheat somaclones was implemented using IRAP-marker. Combination of two types of primers in PCR was shown to be effective in estimating the level of polymorphism in regenerated plants and their differences in genetic structure from the initial forms.

Key words: molecular-genetic markers, polymorphism, DNA markers.

РГП «Национальный центр биотехнологии
Республики Казахстан» Комитета науки
Министерства образования и науки РК,

010000 Казахстан, г. Астана, ул. Валиханова, 43,
e-mail: lbps@biocenter.kz;
ООО «Биоком»,
119435 г. Москва, ул. Малая Пироговская, 29а,
e-mail: biokom@biokom.ru;
ФГОУ ВПО Российский государственный
аграрный университет
-МСХАим. К.А. Тимирязева,
127550г. Москва, ул. Тимирязевская, 49,
e-mail: vglazko@yahoo.com

Поступила в редакцию
27 мая 2008 года

 

Оформление электронного оттиска

назад в начало