ПОЛНОГЕНОМНЫЕ АССОЦИАТИВНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ПОКАЗАТЕЛЕЙ РАЗВИТИЯ СЕМЕННИКОВ У ПЕТУХОВ (Gallus gallus L.)

Репродуктивная способность — один из основных показателей, определяющих племенную ценность самцов. Он зависит прежде всего от функционального состояния клеток семенников. Фертильность самцов определяется сложными физиологическими процессами, затрагивающими образование зрелых половых клеток — спермиев в процессе сперматогенеза. Формирование и накопление половых клеток происходит в семенных канальцах семенников, в связи с чем оценка развития гонад может служить одним из показателей, характеризующих сперматогенез и репродуктивный потенциал самцов. В ряде исследований на сельскохозяйственных животных, включая птицу, показана генетическая обусловленность этого признака. Выявлены соответствующие однонуклеотидные полиморфизмы SNPs и гены, детерминирующие рост и развитие мужских гонад. В настоящем сообщении представлены результаты GWAS-исследований массы и морфометрических показателей семенников петухов (Gallus gallus L.) F₂ ресурсной популяции. Впервые идентифицированы новые достоверно значимые SNPs и гены-кандидаты (р < 1,05×10^-4), детерминирующие рост и развитие гонад у петухов. Целью работы был поиск и идентификация генов, ассоциированных с массой и морфометрическими параметрами семенников у петухов. Объектом исследований были петухи F₂ модельной ресурсной популяции (n = 115), полученной посредством межпородного скрещивания двух пород — русская белая и белый корниш.Материалом для получения ДНК служила пульпа пера. ДНК выделяли с использованием коммерческого набора ДНК Экстран-2 (ООО «НПФ Синтол», Россия) в соответствии с протоколом, рекомендованным производителем. Генотипирование проводили с использованием чипов средней плотности Illumina Chicken 60K SNP iSelect BeadChip («Illumina, Inc.», США). В возрасте 63 сут после экспериментального убоя птицы определяли массу и изучали морфометрические показатели развития (длина, толщина) семенников. На основании полученных генотипических и фенотипических данных у петухов F₂ ресурсной популяции был проведен GWAS-анализ с помощью программного обеспечения PLINK 1.9. Исследованная популяция петухов характеризовалась высоким коэффициентом изменчивости по изученным показателям. Коэффициент изменчивости по массе семенника достигал 96,1 %, по линейным промерам — 39,1 %. Масса и линейные промеры левого семенника были на 5-14 % выше значений, полученных для правого (р ≤ 0,05). GWAS-анализ выявил 36 достоверно значимых SNPs (р < 1,05×10^-4), ассоциированных с показателями роста и развития семенников петушков в возрасте 63 сут, в частности с массой, длиной и толщиной семенника — соответственно 3, 26 и 7 SNPs. SNPs были локализованы на хромосомах GGA1, GGA3, GGA6, GGA7, GGA12, GGA15 и GGA18. В области выявленных SNPs идентифицировано 156 генов, в том числе 16 генов, совпадающих с позициями таких SNPs, в частности 1 ген (WNT7A), связанный с массой семенников, 13 генов (LHFPL1, GALNT3, TMEM198, CACNA2D3, CCDC66, CACNA1D, DENND6A, CELSR3, WNT7A,IP6K2, ERC2, ABHD6, DEPDC5) — с длиной семенника, 3 гена (ESR1, POLE, RNFT2) — с толщиной семенника. Результаты исследования могут быть использованы в геномной селекции на повышение репродуктивного потенциала петухов.

Ключевые слова: Gallus gallus, петухи, GWAS, SNPs, гены-кандидаты, семенники, репродуктивный потенциал.

Воспроизводительная способность самцов сельскохозяйственных животных, включая птицу, — один их ключевых критериев, определяющих их племенную ценность (1, 2). Фертильность и реализация репродуктивного потенциала самцов зависят от множества генетических (3-6) и негенетических (7-10) факторов и определяются прежде всего количественными и качественными характеристиками семени (11-13).

Формирование, развитие и созревание половых клеток самцов происходят в процессе сперматогенеза, включающего несколько стадий дифференцировки половых клеток от сперматогониев до зрелых половых клеток — спермиев (14, 15). Все стадии сперматогенеза протекают в гонадах самцов — семенниках. В мужских гонадах происходит закладка, формирование, созревание, накопление и хранение половых клеток. В гонадах самцов также вырабатывается половой гормон тестостерон, регулирующий процесс сперматогенеза (14, 16). То есть от функционального состояния и степени развития мужских гонад зависит полноценность протекания сперматогенеза. С учетом этого оценка развития семенников может рассматривается как один из простых и эффективных методов характеристики воспроизводительной способности самцов и прогнозирования их репродуктивного потенциала.

В ряде исследований установлена взаимосвязь размеров семенников с репродуктивными признаками самцов, в том числе с показателями качества семени и возрастом полового созревания (17, 18). Показана положительная корреляция размеров семенников с объемом эякулята, концентрацией спермы, подвижностью сперматозоидов, долей спермиев с нормальной морфологией (17-19).

На сегодняшний день достигнуты определенные успехи в изучении генетических механизмов формирования и проявления репродуктивных признаков у самцов сельскохозяйственных животных и птицы. Эти работы проводятся с помощью ассоциативных исследований (20, 21) и особенно полногеномных ассоциативных исследований (genome-wide association studies, GWAS) (22-24). Выявлены и идентифицированы гены-кандидаты, связанные с ростом и развитием мужских гонад у разных видов животных, в том числе у хряков (25, 26), баранов (27, 28), козлов (29), петухов (30), рыб (31). Таким образом, поиск и идентификация генов, ассоциированных с показателями развития мужских гонад, актуальны и востребованы в связи с задачами селекции и отбора самцов с высоким репродуктивным потенциалом, Удобной информативной моделью для проведения таких молекулярно-генетических исследований служат F2 ресурсные популяции (32, 33).

В настоящем сообщении представлены результаты GWAS-исследований массы и морфометрических показателей семенников петухов F2 ресурсной популяции. Впервые идентифицированы новые достоверно значимые SNPs и гены-кандидаты, детерминирующие рост и развитие гонад у петухов.

Целью работы был поиск и идентификация генов, ассоциированных с массой и морфометрическими параметрами семенников у петухов.

Методика. Объектом исследований были петухи (Gallus gallus L.) F2 ресурсной популяции (n = 115) (физиологический двор ФГБНУ ФИЦ ВИЖ им. академика Л.К. Эрнста, 2023-2024 годы). Ресурсную популяцию получали посредством межпородного скрещивания пород русская белая (34, 35) и белый корниш (35).

Птицу содержали в помещениях с приточной вентиляцией. Цыплят до 3-недельного возраста выращивали в брудерах с постепенным понижением температуры с 37 до 25 °С, а затем переводили на напольное содержание. На каждом этапе птица имела постоянный доступ к полнорационному комбикорму и свежей воде.

Экспериментальный убой самцов проводили в возрасте 63 сут. Семенники извлекали и оценивали по массе и линейным параметрам (длина, толщина). Взвешивание осуществляли на аналитических весах OHAUS Pioneer PA413C («OHAUS», США), линейные промеры семенников проводили с использованием электронного штангенциркуля.

Материалом для получения ДНК служила пульпа пера. ДНК выделяли с использованием коммерческого набора ДНК Экстран-2 (ООО «НПФ Синтол», Россия) в соответствии с протоколом, рекомендованным производителем. Качество ДНК оценивали на спектрофотометре NanoPhotometer N60 («Thermo Fisher Scientific», США), отбирали пробы с соотношением OD260/280 больше 1,8. Концентрацию ДНК определяли на флуориметре Qubit 2.0 («Invitrogen/Life Technologies», США) c использованием набора для количественного определения ДНК Qubit dsDNA BR Assay («Invitro-gen/Life Technologies», США).

Птицу генотипировали с помощью ДНК-чипа Illimina Chicken iSelect BeadChip, содержащего 60 тыс. SNPs («Illumina, Inc.», США), на приборе iScan Reader («Illumina, Inc.», США). Полученные данные загружали в программу GenomeStudio 2.0 («Illumina, Inc.», США) для предварительного анализа. Контроль качества и фильтрацию данных генотипирования выполняли для каждого образца (программный пакет PLINK 1.9, http://zzz.bwh.har-vard.edu/plink/, фильтры: --mind 0.10; --geno 0.1; --maf 0.03).

Для поиска генов-кандидатов, локализованных в области идентифицированных SNPs, использовали геномный ресурс Gallus gallus (chicken) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/datasets/genome/?taxon=9030). Функциональные аннотации генов проводили с привлечением базы данных GeneCards (http://www.genecards.org/) и программы DAVID (https://david.ncifcrf.gov/).

Статистическую обработку осуществляли с использованием пакета для анализа данных в приложении Microsoft Excel. Вычисляли средние значения показателей (М), стандартные ошибки средних (±SEM), минимальные (min) и максимальные (max) значения, коэффициенты вариации (Cv, %).

Результаты. В возрасте 63 сут показатели роста и развития семенников у гибридных самцов F2 ресурсной популяции характеризовались высокой вариабельностью (табл. 1). Коэффициент изменчивости по показателю массы семенника достигал 96,1 %, по линейным промерам — 39,1 %.

Следует отметить различия по показателям, установленным для правого и левого семенников. Масса и линейные промеры левого семенника были на 5-14 % выше (р ≤ 0,05) значений, полученных для правого.

GWAS-анализ выявил 36 достоверно значимых SNPs (р < 1,05×10-4), ассоциированных с показателями роста и развития семенников у петушков в возрасте 63 сут, в частности с массой, длиной и толщиной семенника — соответственно 3, 26 и 7 SNPs (табл. 2). Эти SNPs были локализованы на хромосомах GGA1, GGA3, GGA6, GGA7, GGA12, GGA15 и GGA18. Наибольшее число SNPs обнаружили на хромосомах GGA12 и GGA15 (соответственно 15 и 7 SNPs), наименьшее — на GGA6 и GGA18 (1-2 SNPs).

Выявленные SNPs были использованы для аннотирования генов-кандидатов, ассоциированных с показателями развития семенников у петушков в возрасте 63 сут. Структурная аннотация выявила 156 генов, в том числе 16 генов, локализованных в позициях идентифицированных SNPs (табл. 3). Гены локализовались на пяти хромосомах — GGA1 (1 ген), GGA3 (1 ген), GGA7 (2 гена), GGA12 (9 генов) и GGA15 (3 гена).

Наибольшее число генов было установлено для длины семенника — 91 ген, из них 13 генов (LHFPL1, GALNT3, TMEM198, CACNA2D3, CCDC66, CACNA1D, DENND6A, CELSR3, WNT7A, IP6K2, ERC2, ABHD6, DEPDC5) располагались в позициях выявленных SNPs на хромосомах GGA1 (1 ген), GGA7 (2 гена), GGA12 (9 генов) и GGA15 (1 ген). Для показателей масса и толщина семенника было установлено соответственно 14 и 52 гена, связанных с этими признаками, в том числе 4 гена в позициях выявленных SNPs: WNT7A на GGA12, ESR1 на GGA3, POLE и RNFT2 на GGA15 (см. табл. 3).

Рост и развитие семенников — важные признаки, характеризующие репродуктивный потенциал самцов. Для ряда генов-кандидатов, локализованных в позициях идентифицированных SNPs, описаны биологические функции. Так, выявленные гены отвечают за развитие нервной и репродуктивной систем, участвуют в формировании репродуктивных органов (http://www.genecards.org/). Для 5 генов-кандидатов, идентифицированных нами, показана связь с селекционно значимыми признаками у кур. В частности, установлены высокодостоверные ассоциации гена ESR1 с репродуктивными признаками (36-38) и показателями яичной продуктивности (39) у кур, а также массой цыплят (38). Сообщалось о влиянии генов CACNA1D,WNT7Aи CACNA2D3 на показатели яичной продуктивности кур — прочность (40) и цвет (41) скорлупы, продолжительность периода яйцекладки (42), яйценоскость (43). Показано влияние гена IP6K2 на эффективность конверсии корма у бройлеров (44). Для других выявленных нами генов-кандидатов установлена связь с репродуктивными и продуктивными признаками у других видов сельскохозяйственных животных и птицы. Так, обнаружены достоверные ассоциации гена CACNA1D с фертильностью коров (45), LHFPL1 — с репродуктивными признаками у свиней (46). Описано влияние гена ESR1 на показатели яйценоскости перепелов (47) и гусей (48), ERC2 и RNFT2 — на молочную продуктивность и качество молока буйволов (49, 50).

Итак, по результатам GWAS исследования идентифицированы однонуклеотидные полиморфизмы SNPs и гены-кандидаты, которые ассоциированы с массой, длиной и толщиной семенников у 63-суточных петухов F2 ресурсной популяции, полученной при скрещивании пород русская белая и белый корниш. Выявлено 36 значимых SNPs (р < 1,05×10^-4), связанных с этими показателями и локализованных на хромосомах GGA1, GGA3, GGA6, GGA7, GGA12, GGA15 и GGA18. Установлено 156 генов-кандидатов, в том числе 16 генов, локализованных в пределах идентифицированных SNPs, в частности 1 ген (WNT7A), связанный с массой семенников, 13 генов (LHFPL1, GALNT3, TMEM198, CACNA2D3, CCDC66,CACNA1D, DENND6A, CELSR3, WNT7A, IP6K2, ERC2, ABHD6, DEPDC5) — с длиной семенника, 3 гена (ESR1, POLE, RNFT2) — с толщиной семенника. Полученные результаты могут быть полезны для выяснения генетических механизмов сперматогенеза, формирования и развития мужских гонад и разработки молекулярных маркеров, которые позволят отбирать особей с генетически высоким репродуктивным потенциалом.

ЛИТЕРАТУРА

1. Coulter G.H., Foote R.H. Bovine testicular measurements as indicators of reproductive performance and their relationship to productive traits in cattle: a review. Theriogenology, 1979, 11(4): 297-311 (doi: 10.1016/0093-691x(79)90072-4).
2. Thundathil J.C., Dance A.L., Kastelic J.P. Fertility management of bulls to improve beef cattle productivity. Theriogenology, 2016, 86(1): 397-405 (doi: 10.1016/j.theriogenology.2016.04.054).
3. Guo S., Liu Y., Xu Y., Gai K., Cong B., Xing K., Qi X., Wang X., Xiao L., Long C., Guo Y., Chen L., Sheng X. Identification of key genes affecting sperm motility in chicken based on whole-transcriptome sequencing. Poultry Science, 2023, 102(12): 103135 (doi: 10.1016/j.psj.2023.103135).
4. Zhang G., Liu P., Liang R., Ying F., Liu D., Su M., Chen L., Zhang Q., Liu Y., Liu S., Zhao G., Li Q. Transcriptome analysis reveals the genes involved in spermatogenesis in white feather broilers. Poultry Science, 2024, 103(4): 103468 (doi: 10.1016/j.psj.2024.103468).
5. Dunn I.C., Miao Y.-W., Morris A., Romanov M.N., Wilson P.W., Sharp P.J. The detection and assay of polymorphism in candidate reproductive gene loci in a commercial broiler breeder population for association studies. Proc. of the Poultry Genetics Symposium. Working Group 3 of WPSA, Lohmann Tierzucht, Cuxhaven, Germany, 1999: 113.
6. Dunn I.C., Miao Y.-W., Morris A., Romanov M.N., Wilson P.W., Waddington D., Sharp P.J. Candidate genes and reproductive traits in a commercial broiler breeder population, an association study. Journal of Animal Science, 2001, 79(Suppl 1): 43.
7. Byrne C.J., Fair S., English A.M., Urh C., Sauerwein H., Crowe M.A., Lonergan P., Kenny D.A. Effect of breed, plane of nutrition and age on growth, scrotal development, metabolite concentrations and on systemic gonadotropin and testosterone concentrations following a GnRH challenge in young dairy bulls. Theriogenology, 2017, 96: 58-68 (doi: 10.1016/j.theriogenology.2017.04.002).
8. Brito L.F.C., Barth A.D., Wilde R.E., Kastelic J.P. Effect of growth rate from 6 to 16 months of age on sexual development and reproductive function in beef bulls. Theriogenology, 2012, 77(7): 1398-1405 (doi: 10.1016/j.theriogenology.2011.11.003).
9. Gaviley O.V., Tereshchenko O.V., Artemenko O.B., Ogurtsova N.S. Fertilizing capacity of spermatozoa of roosters in experimental T-2 toxicosis. Ptakhivnytstvo, 2009, 63: 156-160.
10. Мамонтова Т.В., Селионова М.И., Айбазов А.-М.М. Половая активность и спермопродукция у баранов пород шароле и иль-де-франс в разные сезоны года. Сельскохозяйственная биология [Agricultural Biology], 2021, 56(4): 752-762 (doi: 10.15389/agrobiology.2021.4.752rus).
11. Абилов А.И., Комбарова Н.А., Амерханов Х.А., Шеметюк С.А., Шамшидин А.С., Мымрин С.В., Пыжова Е.А., Боголюбова Н.В., Гудилина А.А., Абилова С.Ф., Комбаров П.Г., Митяшова О.С. Метаболический профиль и спермопродукция у голштинских быков-производителей зарубежной селекции при содержании в разных климатических и геохимических условиях в России и Казахстане. Сельскохозяйственная биология[Agricultural Biology], 2021, 56(4): 730-751 (doi: 10.15389/agrobiology.2021.4.730rus).
12. Сахацкий Н.И., Терещенко А.В., Артеменко А.Б. Экспресс-метод оценки оплодотворяющей способности замороженно-оттаянной спермы сельскохозяйственной птицы. Сельскохозяйственная биология, 1987, 12: 77-80.
13. Атрощенко М.М., Енгалычева М.Г., Шитикова А.М. Оценка окислительной модификации белков спермоплазмы жеребцов (EquusferuscaballusL.) разного возраста. Сельскохозяйственная биология[Agricultural Biology], 2023, 58(4): 660-668 (doi: 10.15389/agrobiology.2023.4.660rus).
14. Estermann M.A., Major A.T., Smith C.A. Genetic regulation of avian testis development. Genes, 2021, 12(9): 1459 (doi: 10.3390/genes12091459).
15. Белоглазова Е.В., Котова Т.О., Волкова Н.А., Волкова Л.А., Зиновьева Н.А., Эрнст Л.К. Возрастная динамика сперматогенеза у петухов в связи с оптимизацией сроков биоинженерных манипуляций. Сельскохозяйственная биология, 2011, 6: 60-64.
16. Kirby J.D., Froman D.P. Reproduction in male birds. In: Sturkie's avian physiology (fifth edition) /G. Causey Whittow (ed.). Academic Press, New York, 2000: 597-615 (doi: 10.1016/B978-012747605-6/50024-9).
17. Jacyno E., Kawęcka M., Pietruszka A., Sosnowska A. Phenotypic correlations of testes size with semen traits and the productive traits of young boars. Reproduction in Domestic Animals, 2015, 50(6): 926-930 (doi: 10.1111/rda.12610).
18. Terakado A.P.N., Boligon A.A., Baldi F., Silva J.A., Albuquerque L.G. Genetic associations between scrotal circumference and female reproductive traits in Nelore cattle. Journal of Animal Science, 2015, 93(6): 2706-2713 (doi: 10.2527/jas.2014-8817).
19. Ugwu S.O.C., Onyimonyi A.E., Foleng H. Testicular development and relationship between body weight, testis size and sperm output in tropical boars. African Journal of Biotechnology, 2009, 8: 1165-1169.
20. Romanov M.N., Miao Y.W., Wilson P.W., Morris A., Sharp P.J., Dunn I.C. Detection and assay of polymorphism in reproductive gene loci in a commercial broiler breeder population for use in association studies. Proc. Conf. «From Jay Lush to Genomics: Visions for Animal Breeding and Genetics» /J.C.M. Dekkers, S.J. Lamont, M.F. Rothschild (eds.). Iowa State University, Department of Animal Science, Ames, IA, USA, 1999.
21. Dunn I.C., Miao Y.-W., Morris A., Romanov M.N., Waddington D., Wilson P.W., Sharp P.J. Association between candidate genes and reproductive traits in a commercial broiler breeder population. British Poultry Science, 2001, 42(Suppl 1): S113-S114 (doi: 10.1080/00071660152681692).
22. Dementieva N.V., Dysin A.P., Shcherbakov Y.S., Nikitkina E.V., Musidray A.A., Petrova A.V., Mitrofanova O.V., Plemyashov K.V., Azovtseva A.I., Griffin D.K., Romanov M.N. Risk of sperm disorders and impaired fertility in frozen-thawed bull semen: a genome-wide association study. Animals, 2024, 14(2): 251 (doi: 10.3390/ani14020251).
23. Nikitkina E.V., Dementieva N.V., Shcherbakov Y.S., Atroshchenko M.M., Kudinov A.A., Samoylov O.I., Pozovnikova M.V., Dysin A.P., Krutikova A.A., Musidray A.A., Mitrofanova O.V., Plemyashov K.V., Griffin D.K., Romanov, M.N. Genome-wide association study for frozen-thawed sperm motility in stallions across various horse breeds. Animal Bioscience, 2022, 35(12): 1827-1838 (doi: 10.5713/ab.21.0504).
24. Dementeva N.V., Kudinov A.A., Mitrofanova O.V., Stanishevskaya O.I., Fedorova E.S., Romanov M.N. Genome-wide association study of reproductive traits in a gene pool breed of the Russian White chickens. Reproduction in Domestic Animals, 2018, 53(S2): 123-124 (doi: 10.1111/rda.13272).
25. Zhao Y., Zhang L., Wang L., Zhang J., Shen W., Ma Y., Ding C., Wu G. Identification and analysis of genes related to testicular size in 14-day-old piglets. Animals, 2024, 14(1): 172 (doi: 10.3390/ani14010172).
26. Große-Brinkhaus C., Storck L.C., Frieden L., Neuhoff C., Schellander K., Looft C., Tholen E. Genome-wide association analyses for boar taint components and testicular traits revealed regions having pleiotropic effects. BMCGenetics, 2015, 16: 36 (doi: 10.1186/s12863-015-0194-z).
27. Bai M., Sun L., Zhao J., Xiang L., Cheng X., Li J., Jia C., Jiang H. Histological analysis and identification of spermatogenesis-related genes in 2-, 6-, and 12-month-old sheep testes. The Science of Nature, 2017, 104: 84 (doi: 10.1007/s00114-017-1505-1).
28. Xu H., Sun W., Pei S., Li W., Li F., Yue X. Identification of key genes related to postnatal testicular development based on transcriptomic data of testis in Hu sheep. Frontiers in Genetics, 2021, 12: 773695 (doi: 10.3389/fgene.2021.773695).
29. Zou Y., Chen X., Tian X., Guo W., Ruan Y., Tang W., Fu K., Ji T. Transcriptomic analysis of the developing testis and spermatogenesis in Qianbei Ma goats. Genes, 2023, 14(7): 1334 (doi: 10.3390/genes14071334).
30. Zhang H., Na W., Zhang H.-L., Wang N., Du Z.-Q., Wang S.-Z., Wang Z.-P., Zhang Z., Li H. TCF21 is related to testis growth and development in broiler chickens. Genetics Selection Evolution,2017, 49(1): 25 (doi: 10.1186/s12711-017-0299-0).
31. Ding J., Tang D., Zhang Y., Gao X., Du C., Shen W., Jin S., Zhu J. Transcriptomes of testes at different developmental stages in the Opsariichthys bidens predict key genes for testis development and spermatogenesis. Marine Biotechnology, 2023, 25: 123-139 (doi: 10.1007/s10126-022-10186-0).
32. Герман Н.Ю., Волкова Н.А., Ларионова П.В., Ветох А.Н., Волкова Л.А., Сермягин А.А., Шахин А.В., Аншаков Д.В., Фисинин В.И., Зиновьева Н.А. Полногеномные ассоциативные исследования показателей роста у перепелов Coturnix japonica. Сельскохозяйственная биология[Agricultural Biology], 2022, 57(6): 1136-1146 (doi: 10.15389/agrobiology.2022.6.1136rus).
33. Волкова Н.А., Герман Н.Ю., Ларионова П.В., Ветох А.Н., Романов М.Н., Зиновьева Н.А. Идентификация SNPs и генов-кандидатов, ассоциированных с отложением абдоминального жира у перепелов Coturnix japonica. Сельскохозяйственная биология[Agricultural Biology], 2023, 58(6): 1079-1087 (doi: 10.15389/agrobiology.2023.6.1079rus).
34. Abdelmanova A.S., Dotsev A.V., Romanov M.N., Stanishevskaya O.I., Gladyr E.A., Rodionov A.N., Vetokh A.N., Volkova N.A., Fedorova E.S., Gusev I.V., Griffin D.K., Brem G., Zinovieva N.A. Unveiling comparative genomic trajectories of selection and key candidate genes in egg-type Russian White and meat-type White Cornish chickens. Biology, 2021, 10(9): 876 (doi: 10.3390/biology10090876).
35. Romanov M.N., Shakhin A.V., Abdelmanova A.S., Volkova N.A., Efimov D.N., Fisinin V.I., Korshunova L.G., Anshakov D.V., Dotsev A.V., Griffin D.K., Zinovieva N.A. Dissecting selective signatures and candidate genes in grandparent lines subject to high selection pressure for broiler production and in a local Russian chicken breed of Ushanka. Genes, 2024, 15(4): 524 (doi: 10.3390/genes15040524).
36. Luo W., Huang X., Li J., Gu L. Investigating the genetic determination of duration-of-fertility trait in breeding hens. Scientific Reports, 2024, 14: 14819 (doi: 10.1038/s41598-024-65675-0).
37. Rostamzadeh Mahdabi E., Esmailizadeh A., Ayatollahi Mehrgardi A., Asadi Fozi M. A genome-wide scan to identify signatures of selection in two Iranian indigenous chicken ecotypes. Genetics Selection Evolution, 2021, 53: 72 (doi: 10.1186/s12711-021-00664-9).
38. Chu J., Ma Y., Song H., Zhao Q., Wei X., Yan Y., Fan S., Zhou B., Li S., Mou C. The genomic characteristics affect phenotypic diversity from the perspective of genetic improvement of economic traits. iScience, 2023, 26(4): 106426 (doi: 10.1016/j.isci.2023.106426).
39. Niu X., Tyasi T.L., Qin N., Liu D., Zhu H., Chen X., Zhang F., Yuan S., Xu R. Sequence variations in estrogen receptor 1 and 2 genes and their association with egg production traits in Chinese Dagu chickens. The Journal of Veterinary Medical Science, 2017, 79: 927-934 (doi: 10.1292/jvms.17-0014).
40. Zhang Q., Zhu F., Liu L., Zheng C.W., De Wang H., Hou Z.C., Ning Z.H. Integrating transcriptome and genome re-sequencing data to identify key genes and mutations affecting chicken eggshell qualities. PLoS ONE, 2015, 10: e0125890 (doi: 10.1371/journal.pone.0125890).
41. Wang X.G., Shen M.M., Lu J., Dou T.C., Ma M., Guo J., Wang K.H., Qu L. Genome-wide association analysis of eggshell color of an F2 generation population reveals candidate genes in chickens. Animal, 2024, 18(6): 101167 (doi: 10.1016/j.animal.2024.101167).
42. Wang J., Liu Z., Cao D., Liu J., Li F., Han H., Han H., Lei Q., Liu W., Li D., Wang J., Zhou Y. Elucidation of the genetic determination of clutch traits in Chinese local chickens of the Laiwu Black breed. BMC Genomics, 2023, 24(1): 686 (doi: 10.1186/s12864-023-09798-0).
43. Zhang T., Chen L., Han K., Zhang X., Zhang G., Dai G., Wang J., Xie K. Transcriptome analysis of ovary in relatively greater and lesser egg producing Jinghai Yellow Chicken. Animal Reproduction Science, 2019, 208: 106114 (doi: 10.1016/j.anireprosci.2019.106114).
44. Shah T.M., Patel N.V., Patel A.B., Upadhyay M.R., Mohapatra A., Singh K.M., Deshpande S.D., Joshi C.G. A genome-wide approach to screen for genetic variants in broilers (Gallus gallus) with divergent feed conversion ratio. Molecular Genetics and Genomics, 2016, 291: 1715-1725 (doi: 10.1007/s00438-016-1213-0).
45. Tarekegn G.M., Strandberg E., Andonov S., Båge R., Ask-Gullstrand P., Rius-Vilarrasa E., Christensen J.M, Berglund B. Single-step genome-wide association study uncovers known and novel candidate genomic regions for endocrine and classical fertility traits in Swedish Red and Holstein dairy cows. Livestock Science, 2021, 253: 104731 (doi: 10.1016/j.livsci.2021.104731).
46. Suwannasing R., Duangjinda M., Boonkum W., Taharnklaew R., Tuangsithtanon K. The identification of novel regions for reproduction trait in Landrace and Large White pigs using a single step genome-wide association study. Asian-Australasian Journal of Animal Sciences, 2018, 31(12): 1852-1862 (doi: 10.5713/ajas.18.0072).
47. Wu Y., Pan A.L., Pi J.S., Pu Y.J., Du J.P., Liang Z.H., Shen J. SNP analysis reveals estrogen receptor 1 (ESR1) gene variants associated with laying traits in quails. Archives Animal Breeding, 2015, 58(2): 441-444 (doi: 10.5194/aab-58-441-2015).
48. Ouyang Q., Xie H., Hu S., Lan C., Ran M., Hu J., He H., Li L., Liu H., Qu H., Wang J. Comparative genomics study between high and low laying goose breeds reveals the important role of ESR1 in laying ability. Journal of Integrative Agriculture, 2023 (doi: 10.1016/j.jia.2023.05.028).
49. Lázaro S.F., Tonhati H., Oliveira H.R., Silva A.A., Nascimento A.V., Santos D.J.A., Stefani G., Brito L.F. Genomic studies of milk-related traits in water buffalo (Bubalus bubalis) based on single-step genomic best linear unbiased prediction and random regression models. Journal of Dairy Science, 2021, 104(5): 5768-5793 (doi: 10.3168/jds.2020-19534).
50. Venturini G.C., Cardoso D.F., Baldi F., Freitas A.C., Aspilcuetaborquis R.R., Santos D.J., Camargo G.M., Stafuzza N.B., Albuquerque L.G., Tonhati H. Association between single-nucleotide polymorphisms and milk production traits in buffalo. Genetics and Molecular Research, 2014, 13: 10256-10268 (doi: 10.4238/2014.December.4.20).

ORCID:
Volkova N.A. orcid.org/0000-0001-7191-3550
Kotova T.O. orcid.org/0000-0003-4560-7810
Vetokh A.N. orcid.org/0000-0002-2865-5960
Volkova L.A. orcid.org/0000-0002-9407-3686
Romanov M.N. orcid.org/0000-0003-3584-4644
Zinovieva N.A. orcid.org/0000-0003-4017-6863
Larionova P.V. orcid.org/0000-0001-5047-1888
Petrov S.N. orcid.org/0000-0001-5130-677X

Reproductive ability is one of the main indicators of the male breeding value that depends primarily on the functional state of testes cells. Male fertility is defined by complex physiological processes affecting the formation of mature germ cells, i.e., spermatozoa in the process of spermatogenesis. The forming and accumulation of germ cells occur in the seminiferous tubules of the testes, therefore the gonad development can serve as an indicator characterizing spermatogenesis and the reproductive potential of males. A number of studies on farm animals, including poultry, have shown the genetic determinacy of this trait, with identification of respective single nucleotide polymorphisms (SNPs) and genes determining the male gonad growth and development. In the present investigation, a genome-wide association study (GWAS) of the testes development parameters in roosters (Gallus gallus L.) of the F₂ resource population were conducted. For the first time, new significant SNPs and candidate genes (р < 1.05×10^-4) determining gonad growth and development in roosters were identified. The aim of the research was to seek SNPs and identify genes associated with testes growth parameters in roosters. The object of the study were F₂ roosters from a model resource population (n = 115) that was obtained by interbreeding two breeds, Russian White and White Cornish. DNA was extracted from feather pulp using a commercial kit DNK Extran-2 (OOO NPF Sintol, Russia) in accordance with the manufacturer’s protocol. Genotyping was carried out using the medium-density Illumina Chicken 60K SNP iSelect BeadChip chip. At the age of 63 days, the experimental birds were slaughtered and the mass and morphometric indices of testes (length and thickness) were examined. Based on the obtained genotypic and phenotypic data, the GWAS analysis was performed in F₂ resource population roosters using PLINK 1.9 software. The examined population was characterized by a high coefficient of variation in the measured indices, 96.1 % for the testes mass and 39.1 % for the linear measurements. The mass and linear measurements of the left testis were 5-14 % higher (р ≤0.05) compared to the right testis. The GWAS analysis revealed 36 significant SNPs (р < 1.05×10^-4) associated with testes growth and development parameters in 63-day-old cockerels, in particular with the mass, length and thickness of the testes, 3, 26 and 7 SNPs, respectively. SNPs were localized on chromosomes GGA1, GGA3, GGA6, GGA7, GGA12, GGA15, and GGA18. A total of 156 genes were identified in the regions of the detected SNPs, including 16 genes that coincided with the positions of these SNPs. In particular, the latter were one gene (WNT7A) associated with the testis mass, 13 genes (LHFPL1, GALNT3, TMEM198, CACNA2D3, CCDC66, CACNA1D, DENND6A, CELSR3, WNT7A, IP6K2, ERC2, ABHD6, and DEPDC5) associated with the testis length, and three genes (ESR1, POLE, and RNFT2) associated with the testis thickness. These data can be used in genomic selection of roosters aimed at increasing their reproductive potential.

Keywords: Gallus gallus, roosters, GWAS, SNPs, candidate genes, testes, reproductive potential.