doi: 10.15389/agrobiology.2016.4.450rus
УДК 636.52/.58:576.3/.7.086.83:591.04
Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РНФ № 16-16-10059. В проведении исследований было использовано оборудование ЦКП «Биоресурсы и биоинженерия сельскохозяйственных животных» ВИЖ им. академика Л.К. Эрнста.
ВЫДЕЛЕНИЕ, КУЛЬТИВИРОВАНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА
СПЕРМАТОГОНИЕВ ПЕТУХА (Gallus gallus)
Н.А. ВОЛКОВА, С.В. КОРЖИКОВА, Т.О. КОТОВА, А.Н. ВЕТОХ,
Л.А. ВОЛКОВА, Н.А. ЗИНОВЬЕВА
Использование клеток гонад самцов сельскохозяйственных животных и птицы для получения химерных и генетически модифицированных особей рассматривается как альтернатива традиционным методам селекции и модификации генома и открывает широкие возможности для получения особей с новыми заданными свойствами. В случае трансгенеза такой подход предусматривает целенаправленную генетическую модификацию половых клеток самцов при инъекции рекомбинантной ДНК непосредственно в паренхиму семенников взрослых особей (in vivo) или введении трансформированных донорских сперматогониев в семенники стерильных особей-реципиентов (ex vivo) и получении в дальнейшем потомства. В последнем случае ключевые факторы, определяющие эффективность проводимых манипуляций, — получение чистой популяции донорских клеток и элиминация собственных сперматогенных клеток (выключение сперматогенеза). В этой связи остается актуальной разработка эффективных методов выделения и поддержания в культуре стволовых клеток семенников — сперматогониев. Целью наших исследований была оптимизация методических подходов для выделения и культивирования сперматогониев петуха как одного из этапов технологии создания трансгенной птицы. В результате была получена и охарактеризована культура сперматогониев петуха. На основании данных гистологических исследований сперматогенеза у петухов было установлено, что в возрасте до 5 нед сперматогенные клетки представлены преимущественно одним типом клеток — сперматогониями. В связи с этим для получения культуры сперматогониев использовали семенники 2-недельных особей. Выделение сперматогенных клеток из тестикул петуха осуществляли посредством последовательной механической и ферментативной обработок ткани семенника. Для ферментативной диссоциации ткани семенника последовательно обрабатывали раствором коллагеназы в конечной концентрации 1 мг/мл в течение 20 мин и 0,25 % раствором трипсина в течение 30 мин. Для получения максимально чистой популяции сперматогониев учитывали неодинаковую способность разных типов клеток к адгезии. Было установлено, что через 24 ч культивирования первичной культуры тестикул петуха в ростовой среде присутствовали неприкрепившиеся клетки, представленные в основном сперматогенными клетками — сперматогониями. Не прикрепившиеся клетки осаждали и высевали в культуральные чашки с разными фидерными слоями. В качестве фидерных слоев использовали перевиваемую клеточную линию STO, перевиваемые клетки Сертоли свиней (ПТП), клеточную линию Sc, первичные клетки Сертоли петуха. Осуществляли также культивирование сперматогониев на чашках с 0,2 % желатином. Ростовой средой для культивирования сперматогониев служила среда DMEM с высоким содержанием глюкозы (4,5 г/л), дополненная 5 % сывороткой плода коровы («GE Healthcare Life Sciences HyClone Laboratories», США); 2 мМ α-глутамином, МЕМ (Minimum Essential Medium, 10 мкл/мл), антибиотиком (100×), меркаптоэтанолом (5×10-5 М), альбумином (5 мг/мл) («Invitrogen», США); DL-lactic acid (1 мкл/мл), EGF (epidermal growth factor, 20 нг/мл), bFGF (basic fibroblast growth factor, 10 нг/мл) и LIF (leukemia inhibitory factor, 2 нг/мл) («Sigma-Aldrich Сo.», США). Колонии сперматогониев формировались на 3-и-4-е сут культивирования. Оптимальным фидерным слоем для культивирования сперматогониев петуха оказались собственные клетки Сертоли. Наличие колоний сперматогониев подтвердили на 7-суточной культуре иммуногистохимически, использовав специфические антитела к SSEA-1 (stage-specific embryonic antigen-1).
Ключевые слова: сперматогонии, сперматогенные клетки, петухи, культура клеток.
ISOLATION AND CHARACTERIZATION OF ROOSTER (Gallus gallus)
SPERMATOGONIA
N.A. Volkova, S.V. Korzhikova, T.O. Kotova, A.N. Vetokh, L.A. Volkova,
N.A. Zinovieva
Using the male gonad cells of farm animals and poultry in the biotechnological programs to produce chimeric and genetically modified animals is regarded as an alternative to traditional methods of breeding and genome modification and offers great opportunities for obtaining individuals with new desired properties. In transgenesis, this approach provides a targeted genetic modification of male germ cells by introducing the recombinant DNA directly into the testis parenchyma of adults (in vivo), or introducing the transformed donor spermatogonia into testes of a sterile recipient (ex vivo) for further obtaining progeny. In case of introduction of donor spermatogenic cells the key points that determine the effectiveness of the manipulation is to obtain a pure population of donor cells and the elimination of their own spermatogenic cells (spermatogenesis off). In this regard, conducting research related with the development of effective methods for isolating and maintaining the culture of testes stem cells (spermatogonia) is actual. The aim of our study was the optimization of the methodological approaches to the preparation and cultivation of rooster spermatogonia within the development of individual stages for producing transgenic birds. In the experiments we obtained and characterized the culture of rooster spermatogonia. Based on preliminary histological studies of spermatogenesis it was found that in roosters aged under 5 weeks the spermatogenic cells are predominantly presented by one cell type — spermatogonia. In this connection, for obtaining spermatogonia culture the testes from two week old cockerels have been used. Isolation of spermatogenic cells from testicular of rooster was achieved by mechanical and enzymatic treatments of the testis tissue. For enzymatic dissociation of testis tissue we used sequential processing with collagenase solution (at a final concentration of 1 mg/ml) for 20 minutes and 0.25 % trypsin solution for 30 minutes. For obtaining the most pure population of spermatogonia we took into account different capacity of different cell types to adhesion. It was found that after 24 hours of culturing primary culture of rooster testicles the unattached cells were presented mainly by spermatogonia. These cells were pelleted and plated into culture dishes with feeder layers. Continuous cell line STO, transplanted Sertoli cells of swine, a cell line Sc, primary Sertoli cells of rooster were used as feeder layers. Also we carried out the cultivation of spermatogonia on the dishes coated with 0.2 % gelatin. The growth medium for culturing spermatogonial cells was DMEM with high glucose content (4.5 g/l), supplemented with 5 % FCS (Fetal Calf Serum, GE Healthcare Life Sciences HyClone Laboratories, USA), 2 mM α-glutamine (Invitrogen, USA), MEM (Minimum Essential Medium, 10 μl/ml, Invitrogen, USA), antibiotics (100×, Invitrogen, USA), mercaptoethanol (5×10-5 М, Invitrogen, USA), albumin (5 mg/ml, Invitrogen, USA), DL-lactic acid (1 μl/ml, Sigma-Aldrich Сo., USA), epidermal growth factor EGF (20 ng/ml, Sigma-Aldrich Сo., USA), basic fibroblast growth factor bFGF (10 ng/ml, Sigma-Aldrich Сo., USA), leukemia inhibitory factor LIF (2 ng/ml, Sigma-Aldrich Сo., USA). Spermatogonia colonies have been formed at days 3-4 of cultivation. Best results were obtained by culturing the spermatogonia on primary Sertoli cells of rooster. The presence of spermatogonia colonies was confirmed immunohistochemically in 7-day culture using SSEA-1 (stage-specific embryonic antigen-1) specific antibodies.
Keywords: spermatogonia, spermatogenic cells, roosters, cell culture.
ФГБНУ Всероссийский НИИ животноводства |
Потупила |
Оформление электронного оттиска
