Сельскохозяйственная биология, 2011, № 4, с. 108-114.

УДК 619+632.9]:579.8

ИЗМЕНЕНИЕ МИКРОФЛОРЫ ТОЛСТОГО КИШЕЧНИКА У МЫШЕЙ ПРИ ДЛИТЕЛЬНОМ ПЕРОРАЛЬНОМ ВВЕДЕНИИ δ-ЭНДОТОКСИНА Bacillus thuringiensis

Е.Г. КЛИМЕНТОВА¹, А.А. КУПЦОВА¹, Л.К. КАМЕНЕК¹, В.В. ГУЛИЙ²

Изучали частоту распространения условно-патогенных микроорганизмов и гемолитических штаммов Escherichia coli и Staphylococcus aureus в составе микробиоценозов толстой кишки у мышей при дисбактериозе, обусловленном действием δ-эндотоксинов Bacillus thuringiensis. Выявлено появление условно-патогенных микроорганизмов и штаммов гемолитических эшерихий и стафилококков в микрофлоре толстого кишечника при длительном применении высоких доз токсина.

Ключевые слова: δ-эндотоксины Bacillus thuringiensis, микрофлора кишечника, гемолитические штаммы Escherichia coli и Staphylococcus aureus, дисбактериоз.

По результатам ежегодных аналитических исследований экспертов из компании «Abercade» (Россия, http://www.abercade.ru/about/), специализирующейся на изучении промышленных рынков и технологий, биопрепараты, применяемые для контроля численности вредных организмов в сельском и лесном хозяйстве, в настоящее время в основном представлены спорокристаллическими комплексами бактерии Bacillusthuringiensis.
Известно, что белки параспоральных кристаллов, образуемые различными подвидами B. thuringiensis (Cry-белки, или δ-эндотоксины), с высокой специфичностью поражают насекомых, нематод, клещей (1), оказывают фунгиостатическое действие на фитопатогенные грибы (2). В последнее время в России запатентован ряд биоинсектицидов на основе очищенного и активированного δ-эндотоксина B. thuringiensis (битиплекс, дельта и т.п.), имеющих высокий биологический эффект в отношении большого числа вредителей (3). Кроме того, Сry-гены введены в растения для защиты их от вредных насекомых (Bt-растения).
В организм животных и человека Cry-белки могут попадать перорально (с пищей), поэтому представляется весьма актуальным оценить их действие на микрофлору желудочно-кишечного тракта. Известно, что белковые токсины способны оказывать влияние на микроорганизмы, входящие в состав нормального микробиоценоза кишечника: вызывать появление новых патогенных и условно-патогенных штаммов, потенциально обладающих непредсказуемыми свойствами, изменять биологические особенности отдельных представителей микробиоты, селективно ингибировать или, напротив, усиливать их рост, обусловливать дисбиотические нарушения (3). Кроме того, параспоральные белки B. thuringiensis обладают выраженной антибактериальной активностью в отношении ряда прокариотических организмов (4-8).
Целью нашего исследования было изучение влияние перорального введения растворов δ-эндотоксина Bacillusthuringiensis на видовой состав микрофлоры толстого кишечника у модельных теплокровных животных.
Методика. В работе был использован штамм Z-52 B. thuringiensissubsp. kurstaki, продуцирующий кристаллы δ-эндотоксина класса Cry IА, наиболее широко применяемый для создания биоинсектицидов. Параспоральные кристаллы получали после выращивания бактерии на агаризованных питательных средах, отделяя кристаллы от спор по известной методике с помощью п-ксилола (9). От находящихся на поверхности примесей кристаллы отмывали водой и 1 М NaCl, после чего их обрабатывали 0,02 н. NaOH в течение 1 ч при перемешивании для получения раствора, содержащего смесь белков, входящих в состав кристаллов. Для активации протоксинов до токсинов растворы инкубировали с протеазой бактерии-про-дуцента в течение 1-2 сут при комнатной температуре. После этого белки кристаллов осаждали ледяной уксусной кислотой, отделяли от супернатанта центрифугированием и перерастворяли в 0,02 М фосфатном буфере (рН 7,8). Затем готовили растворы белков нужной концентрации в этом буфере (концентрацию определяли на спектрофотометре СФ-26, «ЛОМО», Россия). Полученные растворы использовали для перорального введения лабораторным животным.
 Было использовано 390 белых беспородных мышей — самок со средней живой массой 26±3 г. Содержание, кормление, уход за животными осуществляли в соответствии с требованиями «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу МЗ СССР от 12.08.1977 № 755). Перед каждой серией экспериментов мышей разделяли на 3 группы по 120 особей (опыт): в I, II и III группе животные ежедневно в одно и то же время (первая половина дня) получали внутрижелудочно с помощью зонда в течение 28 сут раствор δ-эндотоксина в количестве соответственно 25, 50 и 100 мг/кг массы (от 0,0075 до 0,0300 мг на особь). Контролем служила IV группа из 30 особей, не получавших токсин. Регистрировали общее состояние и поведение животных, поедаемость корма, качество шерстного покрова, наличие/отсутствие диареи, массу тела. Для исключения влияния на микрофлору кишечника неспецифических факторов, связанных со стрессом, все животные контрольной группы вместо раствора δ-эндотоксина получали физиологический раствор и подвергались тем же манипуляциям, что и особи из опытных групп. На 7-е, 14-е, 21-е и 28-е сут мышей усыпляли эфиром, вскрывали и отбирали фекальные массы из содержимого толстого отдела кишечника (прямая кишка) в стерильную одноразовую посуду для исследования микрофлоры.
Микроорганизмы выделяли с использованием классических бактериологических методов; анализ и типирование выполняли на основании морфологических, биохимических и культуральных признаков (10). Биохимическую идентификацию культур проводили с использованием тест-систем ENTEROtest, STREPTOtest, NEFERMtest, STAPYtest («Lachema», Чехия). Наличие гемолитических эшерихий учитывали на кровяном агаре (после высева из разведения 1:105). 
Статистическую обработку выполняли с использованием программы StatSoft Statistica 6.0. Различия между значениями считали достоверными при р < 0,05.
Результаты. У особей из контрольной IV группы, а также из I и II групп, получавших растворы токсина в дозах 25-50 мг/кг массы, признаков дисбактериоза не отмечали. Мыши были активными, весь предложенный корм поедали без остатка. В III группе дисбиотические признаки (снижение физической активности и аппетита, вздутие живота и диарея) появились уже к концу 1-й нед после начала эксперимента и сохранялись у некоторых особей в течение всего периода наблюдений. На 21-е сут число животных с явными признаками дисбактериоза увеличилось до 12 (или 40,0 % особей), к концу эксперимента (на 28-е сут) — до 14, или 46,7 %.
На 28-е сут от 14 животных из III группы с признаками дисбактериоза при высеве выделили 255 штаммов грамположительных и грамотрицательных условно-патогенных бактерий и грибов, из которых 58,2 % составляли условно-патогенные энтеробактерии (табл. 1). От мышей из контрольной группы всего было выделено 192 штамма микроорганизмов, из которых на долю условно-патогенных грамотрицательных бактерий приходилось 52,6 %, то есть в опыте условно-патогенные грамотрицательные энтеробактерии высевались чаще, чем в контроле.

Среди условно-патогенных грамотрицательных бактерий, высеянных от животных из III группы, преобладала E. сoli, значительную долю составляли бактерии Proteusspp., Klebsiellae spp.,Citrobacter spp. и появились представители новых родов условно-патогенных микроорганизмов, которые не встречались в контроле, — Morganella morganii и Yersinia enterocolitica. В группе условно-патогенных грамположительных бактерий, выделенных от мышей с признаками дисбактериоза, численность эпидермального стафилококка была значительно меньше, чем в контроле, но в большом количестве присутствовали штаммы наиболее патогенного золотистого стафилококка. Значительную долю составили также бактерии рода Enterococcus. В контрольной группе в основном высевались Staphylococcus epidermidis и Enterococcusspp. (см. табл. 1).
Различия в качественном и количественном составе симбионтов, регистрируемые в микрофлоре толстой кишки, позволили предположить наличие сопряженных таксонов условно-патогенных микроорганизмов (Sta-phylococcus—Escherichia), которые у животных, получавших высокие дозы δ-эндотоксина (III группа), встречаются совместно чаще, чем в контроле или у особей из I и II групп, где дозы препарата были ниже. 
Исследование наличия гемолитических штаммов эшерихии и золотистого стафилококка в микрофлоре толстого кишечника при высокой дозе δ-эндотоксина (III группа) показало, что как на 14-е, так и на 28-е сут в микробном пуле обнаруживалось большее число штаммов E. сoli и S. aureusHly⁺, чем в посевах от контрольных мышей (табл. 2). В микрофлоре у животных из I-III групп также чаще обнаруживались лактозонегативные штаммы эшерихий.
Избыточное размножение патогенных и условно-патогенных микроорганизмов (стафилококков, псевдомонад, клебсиелл, протея, эшерихий, клостридий и грибов) или их ассоциаций и появление большого числа гемолитических и лактозонегативных эшерихий и золотистых стафилококков свидетельствуют о формировании патологических биоценозов в кишечнике у животных, получавших длительное время высокие дозы δ-эндотоксина B. thuringiensis, что согласуется с исследованиями ряда авторов о влиянии белковых токсинов на микрофлору кишечника (11, 12).

Существует мнение, что под действием токсичных белков в первую очередь нарушается нормофлора кишечника, поскольку именно она в виде биопленки препятствует их проникновению в макроорганизм. При этом уменьшается популяция форм E. coli с нормальной ферментативной и, соответственно, высокой антагонистической активностью, создавая условия для избыточной колонизации лактозонегативными и гемолитическими штаммами, размножение которых в норме подавлено конкурирующими активными симбионтами (13).
Таким образом, в составе микробиоценоза толстой кишки у теплокровных животных (белых мышей), длительно потреблявших с пищей высокие дозы (более 100 мг/кг живой массы) δ-эндотоксина Bacillus thuringiensis, условно-патогенные энтеробактерии, гемолитические и лактозонегативные штаммы Escherichia coli присутствуют в большом количестве и встречаются достоверно чаще, чем у интактных животных. Это позволяет полагать, что подобные дозы d-эндотоксина могут быть одним их факторов, способствующих появлению указанных групп микроорганизмов в микрофлоре кишечника (механизм развития наблюдаемых дисбиотических отклонений требует дальнейшего изучения). Полученные данные о влиянии Cry-белков на прокариотические симбионты в желудочно-кишечном тракте теплокровных животных представляются важными при оценке экологической безопасности биоинсектицидов на основе метаболитов B. thuringiensis и трансгенных растений, синтезирующих Cry-белки.

Л И Т Е Р А Т У Р А

1. К у к с и  К.Э. Кристаллический белковый токсин B. thuringiensis: биохимия и механизм действия. В сб.: Микроорганизмы в борьбе с вредными насекомыми и клещами. М., 1976: 198-218.
2. К а м е н е к  Л.К.,  С а т а р о в а  Т.А.,  К а м е н е к  Д.В.,  Т е р п и л о в с к и й  М.А. Антифунгальное действие δ-эндотоксина Bacillus thuringiensis в отношении возбудителя фитофтороза картофеля в полевых условиях и при хранении. С.-х. биол., 2011, 1: 112-117.
3. И в а н о в а  Л.А.,  К а м е н е к  Л.К.,  Ш р о л ь  О.Ю.,  Е ж о в а  О.В. Использование микробиопрепарата битиплекс в биологической защите растений.  Фундаментальные исследования, 2006, 1: 87-89.
4. Y u d i n a  T.G.,  B u r t s e v a  L.I. Activity of δ-endotoxins of four Bacillusthuringiensis subspecies against prokaryotes. Microbiology (Moscow), 1997, 66: 25-31.
5. Ю д и н а  Т.Г.,  Е г о р о в  Н.С. Антимикробная активность белковых включений различных бактерий. Докл. РАН, 1996, 349(2): 283-287.
6. Ю д и н а  Т.Г.,  Б р ю х а н о в  А.Л.,  Р е в и н а  Л.П.,  К о с т и н а  Л.И.,  З а л у-
н и н  И.А.,  Ч е с т у х и н а  Г.Г.,  Н е т р у с о в  А.И. Влияние белков параспоральных кристаллов Bacillus thuringiensis и некоторых фрагментов этих белков на анаэробных бактерий. Тез докл. II Межд. конф «Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, биологический потенциал — ICOMID-2005». Пермь, 2005: 109-110.
7. Y u d i n a  T.G.,  E g o r o v  N.S.,  L o r i a  J.K.,  V y b o r n y k h  S.N. Biological activity of Bacillus thuringiensis parasporal crystals. Izv. Akad. Nauk, Ser. Biol. (Moscow), 1988, 5: 535-541.
8. Y u d i n a  T.G.,  M i l’ k o  E.S.,  E g o r o v  N.S. Sensitivity of Micrococcus luteus dissociation variants to d-endotoxins of Bacillus thuringiensis. Microbiology (Moscow), 1996, 65: 365-369.
9. C h e s t u k h i n a  G.G.,  Z a l u n i n  I.A.,  K o s t i n a  L.I.,  K o t o v a  T.S. Crystal-forming proteins of Bacillus thuringiensis. Biochem. J., 1980, 187: 457-465.
10. Б а р а н о в с к и й  А.Ю.,  К о н д р а ш и н  Э.А. Дисбактериоз и дисбиоз кишечника. СПб, 2000.
11. Определитель бактерий Берджи. В 2 т. /Под ред. Дж. Хоулта, Н. Крига, П. Снита и др. М., 1997.
12. К о с т ю к е в и ч  О.И. Современные представления о микробиоценозе кишечника: дисбактериоз и его коррекция. РМЖ, 2007, 2176 (www.rmj.ru).
13. Л о б з и н  Ю.В.,  М а к а р о в а  В.Г.,  К р о в я к о в а  Е.Р.Дисбактериоз кишечника (клиника, диагностика, лечение): Руководство для врачей. СПб, 2003.

EFFECT OF LONG-TERM ORAL ADMINISTRATION OF THE Bacillus thuringiensis δ-ENDOTOXIN ON MICROFLORA OF LARGE INTESTINE IN MOUSE

E.G. Klimentova¹, A.A. Kuptsova¹, L.K. Kamenek¹, V.V. Guliy²

The authors studied the frequency of distribution of conditional pathogenic microorganisms and hemolytic strains of Escherichia coli and Staphylococcus aureus in microbiocenosis of mouse large intestine during dysbacteriosis, due to the action of Bacillus thuringiensis d-endotoxins. The appearance of conditional pathogenic microorganisms and strains of hemolytic E. coli and S. aureus in large intestine microflora during long-term of use of toxin high doses was revealed.

Keywords: Bacillus thuringiensis d-endotoxins, intestinal microflora, hemolytic strains of Escherichia coli and Staphylococcus aureus, dysbacteriosis.

Оформление электронного оттиска