УДК 636:577.2

ИНТЕРФЕРЕНЦИОННАЯ РНК КАК ЗАЩИТА КЛЕТКИ ОТ ТРАНСГЕНЕЗА (обзор)

И.Я. ШИХОВ

Обсуждается современное состояние исследований по внедрению чужеродной ДНК в геном животных или растений. Приведены данные, свидетельствующие о подавлении экспрессии нерегулярной генетической информации с участием так называемых малых интерференционных РНК (РНКi). Интерференция РНК, которая приводит к молчанию (сайленсингу) гена на транскрипционном и/или посттранскрипционном уровне, имеет большое значение в биологии клетки как механизм защиты от вирусных, трансгенных и транспозонных инсерций и периодизации функциональной активности генома в процессе роста и развития организма.

Ключевые слова: трансген, ДНК, интерференция РНК, shРНК, деградация мРНК, Дисер-комплекс, РИСК.

 

В течение последних 20 лет в отделе биотехнологии Всероссийского НИИ животноводства (ВИЖ, Московская обл.) для выведения новых типов сельскохозяйственных животных применяются технологии трансгенеза. Однако при обнадеживающих результатах по изменению морфофункциональных свойств у трансгенных особей их генетические модификации не столь однозначно соответствовали ожидаемым при целевом введении чужеродных ДНК-детерминант, что толковалось по-разному (1, 2). При анализе эффективности используемых генных конструкций оказалось, что, например, в отношении роста подопытных животных данные весьма невыразительны. Другими словами, необходимо детальное изучение биологических основ трансгенеза для разработки методов трансформации, обеспечивающих выход генно-инженерной продукции.  

В настоящем обзоре оцениваются возможные отклонения в реализации генных функций введенных чужеродных последовательностей на основе обобщения данных по экспериментальному трансгенезу и формированию молекулярных механизмов транскрипционного и посттранскрипционного генного молчания (transcription/post transcription gene silencing — TGS и PTGS). 

Т р а н с г е н е з   у   ж и в о т н ы х. В ВИЖ исследования по трансгенезу свиней проводили с 1987 года. Испытывались рекомбинантные конструкции, полученные в Институте молекулярной биологии АН СССР, которые содержали HBsAg (ген поверхностного белка вируса гепатитаВчеловека), НВС (коровый ген того же вируса), bGH (ген гормона роста быка) и ASV-pv(ген антисмысловой РНК парвовируса свиньи). Гены были клонированы в плазмидах pUC19 и поставлены под промоторы металлотионейновых генов мышиmМТ или вирусных генов RSV (вирус саркомы Рауса). После введения указанных генных конструкций в эмбрионы свиней и последующей трансплантации реципиентам получили соответственно 40, 20, 144 и 62 поросенка. Из них положительными по результатам гибридизационного анализа оказались по два в вариантах с HBsAg (5,00 %), bGH (1,38 %) и ASV-pv(3,20 %)(3, 4).   

В содружестве с лабораторией молекулярной биологии животноводства Мюнхенского университета (профессор G. Brem) были также созданы трансгенные свиньи с использованием следующих рекомбинантных кон-струкций: ген гормона роста человека hGH под промотором гена WAP (кислый сывороточный белок молока мыши), ген релизинг-фактора гормона роста человека GHRF под промоторомmМТ, мышиный ген устойчивости к гриппу с собственным промотором mМх-Мх (2). Получены данные по росту и развитию трансгенных животных (в условиях экспериментального хозяйства и физиологического двора ВИЖ) в ряде поколений. Обобщены результаты по 7 поколениям свиней, трансгенных по генам релизинг-фактора гормона роста и гормона роста человека (5), обсуждаются аналогичные данные по следующим (8-е и 9-е) поколениям (6), ведутся биологические и зоотехнические исследования животных 10-го и 11-го поколений.

В целом трансгенные особи по ряду интерьерных признаков отличаются от контроля, однако весьма вариабельны по содержанию гормона роста в крови, а прибавка в скорости роста по сравнению с контролем у них не соответствует ожидаемой. Имеется в виду надежда авторов получить сверхбыстрый прирост живой массы на основании сенсационного сообщения R.D. Palmiter с соавт. (7) о драматичном росте мышей после введения чужеродного крысиного гена гормона роста. Причем аналогичные результаты на мышах были получены в лаборатории T. Vagner (Огайский университет) (устное сообщение, 1983), подтверждения приводятся в других работах (R. Hammer e.a., 1984; G. Brem e.a., 1985; D. Morello e.a., 1986; R. Selden e.a., 1988; A. Bartke e.a., 1988; J. Orian e.a., 1988; цит. по ссылке 8). Однако на других видах животных добиться столь явных результатов не удалось. В частности, на трансгенных свиньях, как указывают B. Brenig и G. Brem (9), эффект высоких уровней экспрессии гормона роста не поддается оценке и не идет в сравнение с данными, полученными на трансгенных мышах. Сбои в экспрессии трансгенов описываются и другими авторами, что указывает на сложность внутриклеточных механизмов, разрешающих транскрипцию и трансляцию чужеродных последовательностей ДНК.

М о л ч а н и е   т р а н с г е н а. Известно, что искусственные гены могут подавлять экспрессию гомологичных эндогенных генов и/или самих трансгенов, уже присутствующих в геноме. Иммунная система, отличающая «себя» от «не себя», и механизмы самозащиты ДНК способны модифицировать чужеродную генетическую информацию, делая ее нефункциональной или исключая вовсе (10). Так, овечий ген β-лактогло-булина достаточно заметно экспрессируется в молочной железе трансгенных мышей, однако присоединение второй генной конструкции, содержащей кДНК млекопитающих или репортерную последовательность гена хлорамфениколацетилтрансферазы (САТ), приводило к снижению его экспрессии в потомстве у большинства трансгенных линий. Авторы полагают, что кДНК млекопитающих и прокариотические репортерные последовательности, к которым относится последовательность САТ, могут создавать активные участки генного молчания в геноме млекопитающих (11). Эффект положения гена на хромосоме при пестроте экспрессии (position expression variegate — PEV) впервые описан у Drosophilamela-nogaster 70 лет назад. В опытах по передаче генов у мышей трансген β-лактоглобулина овцы (BLG/7) обнаруживался около центромеры 15-й хромосомы в виде тандема, состоящего примерно из 25 копий. Пестрота его экспрессии дает представление о характерных особенностях трансгенеза такого типа (12). При изучении 13 поколений линейных мышей описан селективный сайленсинг b-лактоглобулинового трансгена в обратном скрещивании (13). Трансген на фоне эндогенных белковых генов был подвержен специфической депрессии инбридинга. Когда пестрый по экспрессии трансген присутствовал у родителей в смешанной генетической форме, прогрессирующего по генерациям сайленсинга не выявляли, то есть экспрессия оставалась, по сути, константной.

Оценка экспрессии гена β-лактоглобулина овцы у мышей 13-й генерации при обратном скрещивании и у родительской формы (цит. по ссылке 13)

Генотип

Концентрация, мг/мл

n

SD

Сv, %

CBA BLG/7

4,3

18

1,17

27,3

C57BL/6 BLG/7

5,8 

21

1,92       

33,1

BLG/7 (родительская форма)

8,2

19

3,46

42,0

П р и м е ч а н и е. SD — квадратичное отклонение, Сv — коэффициент вариации.

Следовательно, если у млекопитающих существует генный механизм, обеспечивающий молчание чужеродных нуклеотидных последовательностей, то некоторые трансгены (например, у BLG/7) могут быть исключением из этого правила и заметно экспрессироваться в ряду поколений.

Весьма распространенное явление — повторяющиеся копии интегрированных генов, расположенные тандемно. Они обнаруживаются клеткой и «заглушаются» (14, 15). Считается, что такой сайленсинг повторов связан с функцией гетерохроматинподобного комплекса (16).

Как известно, опыты по трансгенезу сначала выполняли на растительных организмах, и уже в первых экспериментах идея экспрессии чужеродных генов оказалась скомпрометированной (17). Выявленное генное молчание считали относящимся исключительно к растениям. Так, у петунии введение конструкции, детерминирующей синтез антоцианинового пигмента, приводило к сайленсингу как трансгенов, так и эндогенных генов. В результате у трансгенных форм вместо ожидаемой более темной окраски цветов наблюдалось их почти полное осветление. Эти процессы описывались как косупрессия, или гомологозависимый генный сайленсинг (HDGS). Затем обратили внимание на трансгенный сайленсинг у дрозофилы, где причиной была названа «холодная конструкция» (cold fusion). У дрозофилы по сравнению с растениями трансгенный сайленсинг характеризовался относительно меньшей степенью выраженности, однако полностью отсутствовал редко. При этом у большинства представленных трансгенов заметный сайленсинг проявлялся при достаточно большом числе копий.

Известно, что увеличение копийности трансгенов у млекопитающих обычно подавляет экспрессию. При этом обнаруживается локальное повышение концентрации двуцепочечной РНК (dsРНК), которая может образовываться в результате двунаправленной транскрипции, что приводит к ген-сайленсингу. Подобное чаще всего происходит при введении в клетку многокопийных форм трансгенов (18). Их супрессия по существу представляет собой естественное следствие активности dsРНК. Таким образом, специальным механизмом супрессии трансгенов служит посттранскрипционное генное молчание (PTGS), действие которого может распространиться и на другие гены с гомологичной последовательностью нуклеотидов (19).

И н т е р ф е р е н ц и я   Р Н К   в   к л е т к е. В 2006 году Нобелевская премия по физиологии и медицине была присуждена профессорам A. Fire (Стэнфордский университет, Калифорния) и C. Mellow (Массачусетская медицинская школа, Ворчестер), обнаружившим, что двуцепочечная РНК при введении в клетку животного вызывает подавление генной активности гомологичных молекулярных структур. Процесс получил название РНК-интерференции (РНКi) и расширил представление о механизмах регуляторных и биохимических преобразований, играющих ключевую роль во многих жизненно важных процессах (20).

Подавление активности мРНК, или РНК-молчание (сайленсинг), на животных впервые описали S. Guo и K. Kempus (1995). По их данным, введение как смысловой, так и антисмысловой РНК для последовательности мРНК гена par-1 приводит к деградации этой мРНКу ленточного червя Caenorhabditiselegans.Подобный феномен отмечали N. Romano и G. Macino (1992) успорового гриба Neurosporacrassa, когда введение гомологичной последовательности РНК подавляло экспрессию эндогенного гена. A. Fire и C. Mellow, изучая состояние генов у С. elegans, пришли к выводу, что в опытах с растениями и грибами подобные факты можно объяснить преобразованием соответствующих трансгенов в двуцепочечные РНК и в случае С. elegans — присутствием фаговой полимеразы, синтезирующей на смысловой РНК двуцепочечную (сенс—антисенс) РНК (цит. по ссылке 21). Такая РНК частично или полностью может подавить экспрессию гена через механизм интерференции РНК (РНКi). Отмеченная система контроля генной активности важна для осуществления как процессов дифференцировки, так и физиологических функций клеток и тканей. Кроме того, РНКi защищает клетки от вирусной инфекции и обеспечивает стабильность гена, поддерживая молчание мобильных генов и «заглушая» трансгены. За последние 10 лет описаны интерференционные РНК, нарушающие работу мРНК ряда генов (10, 21).

При считывании проникшей в клетку чужеродной ДНК наряду со смысловой синтезируется антисмысловая цепь РНК. Эта двуцепочечная РНК (dsРНК) преобразуется в малые (small) интерференционные фрагменты (siРНК), обеспечивающие посттранскрипционную защиту клетки от проникшей информации. В опытах по трансфекции клеток человека in vitro наблюдали образование крупных молекул dsРНК, которые после описанных выше преобразований специфически вызывали посттранскрипционное генное молчание. Метод применялся для подавления активности генов глюкозилцерамидсинтетазы (GCS), белкового предшественника сфинголипидного активатора (SAP) и глюкоцереброксидазы (GBA), участвующих в метаболизме гликосфинголипидов. Вводимая ДНК содержала инвертированную последовательность длиной 1600 п.н. Экспрессированная на ее основе dsРНК (800 п.н.) обеспечивала специфическую репрессию соответствующих генов через РНКi (22).

Таким образом, необходимая для включения механизма РНКi двуцепочечная РНК может поступать извне или образовываться при транскрипции трансгенов, несущих инвертированный повтор. Кроме того, при  интеграции трансгенов в геном хозяина двуцепочечная РНК часто производится в результате аберрантной транскрипции под промотором, располагающимся рядом с сайтом внедрения трансгена. У эукариотов (грибы, растения, простейшие, беспозвоночные и позвоночные) клетки обладают защитной системой, которая распознает такую dsРНКи охраняет геном от чужеродных элементов.В частности, dsРНКрасщепляется до мелких фрагментов, которые обеспечивают специфическую деградацию одноцепочечных мРНК проникших генов (23).

dsРНК размером примерно 21-26 п.н. выполняют в клетке функции репрессоров генной активности: действуя на гомологичные последовательности, они индуцируют сайленсинг. У растений, животных и многих грибов такая РНК описана разными авторами как короткая, или малая, интерферирующая (small interference — siРНК) (S. Elbashir e.a., 2001), малая временная (small temporal — stРНК) (A. Pasquinelli e.a., 2000), гетерохроматиновая (B. Reinhart and D. Bartel, 2002), мельчайшая некодирующая (V. Ambros e.a., 2003) и микроРНК (miРНК) (R. Lee and V. Ambros, 2001; N. Lau e.a., 2001; M. Lagos-Quintana e.a., 2001) (цит. по ссылке 24). Приведенная терминология отражает представления о РНК-интерференции как механизме регуляции генной активности, реализации генетической информации и защиты клеток эукариотов от внедрения чужеродного генетического материала.

s i Р Н К   и   m i Р Н К. A. Thakur (19) приводит следующую классификацию малых РНК-молекул, выполняющих регуляторные функции. siР Н К — имеет определяющее значение в РНК-интерференции, в виде фрагментов длиной 22 нуклеотида направляется к комплементарным мРНК и расщепляет их. stР Н К — такой же длины, как первая, участвует в процессах сайленсинга при развитии некоторых мутантныхформ нематод, образуется из одноцепочечных транскриптов (~ 70 нуклеотидов), формирующих петлевидные структуры; после процессинга эта stРНК, по-видимому, задерживает трансляцию мРНК через присоединение к 3′-нетранслируемому региону (UTR). miР Н К — тоже небольшая РНК, выявлена в опытах на мухах (Drosophila) и в НеLа клетках, образовывалась из предшественников, свернутых в спирально-петлевидные структуры; описано ее участие в регуляции экспрессии генов развития на посттранскрипционном этапе (19).

siРНК отвечает за сайленсинг, инициируемый трансгенами, мик-роинъецированой РНК, вирусами, транспозонами. Другими словами, противодействие чужеродным нуклеотидным последовательностям — одна из важнейших функций РНК-сайленсинга (24).

siРНК могут образовываться из любых областей дуплекса сенс—антисенс РНК, считываемых, как указано выше, с нерегулярных геномных фрагментов. У млекопитающих таким РНК-дуплексом могут быть инвертированные транскрипты многокопийных трансгенов, формирующие шпильки (hairpines РНК — hpРНК) (рис.). Сайленсинг, вызываемый hpРНК, провоцируется экзогенной трансфекцией или эндогенной экспрессией. В ряде лабораторий показано, что существует эндогенный кодирующий фактор запуска механизма РНКi, который транскрибируется в виде малой временнойРНК (stPНК) (~ 70 нуклеотидов), переходящей в активное состояние при расщеплении клеточными ферментами на 21-нуклеотидные фрагменты. Последние взаимодействуют с гомологичными участками мРНК и подвергают ее деградации. Короткие шпилечные РНК (short hairpine РНК — shРНК) вовлечены в деградацию мРНК и подавление экспрессии ряда генов в культурах клеток дрозофилыи млекопитающих. При этом shPНК (как и весь класс малых интерференционных РНК) обладает системными характеристиками и передается от клетки к клетке, а также в поколениях клеток и организмов (25, 26).

Описан пример трансген-сайленсинга в клетках грызунов (27). Сразу же после электропорации крысиных фибробластов коллагеновым трансгеном отмечалось снижение содержания эндогенной РНК более чем на 90 %, при этом трансгенная РНК вообще не обнаруживалась. Упоминается несколько тысяч трансгенов, которые при интродукции в клетки не


Схема процессов, обеспечивающих интерференцию РНК в клетке с участием двуцепочечной РНК эндогенного и экзогенного происхождения (соответственно А и Б, цит. по ссылкам 24 и 34). Rdp — РНК-зависимая РНК-полимераза, синтезирующая двуцепочечную (ds) РНК; Ago— Аргонавт-комплекс, катализирующий процессинг dsРНК; Diser — Дисер; Nuc — нуклеаза (Nuclease, РНКаза III); RISС — РНК-индуцируемый сайленсинг-комплекс; hpТрансген — многокопийная инверсионная шпилечная структура, образуемая трансгеном; siРНК, miРНК и hpРНК — см. в тексте статьи. В ядре: I — Дисер-дробление соответствующих dsРНК, происходящее в ядре при считывании кодовых последовательностей так называемых промежуточных зон растительных и животных геномов; II — метилирование промоторной области гена miРНК; III — считывание hpТрансгена с образованием шпилечной (hp) РНК, переходящей в цитоплазму; IV — обратное действие hpРНК через фазу малой интерференционной РНК (siРНК), образованной с участием Дисер-комплекса, на процесс метилирования центромерной области хромосомы и/или встроенной чужеродной ДНК; V — выход преинтерференционной микроРНК (пре-miРНК), под действием Дисер-комплекса образуется зрелая miРНК (возможное обратное воздействие на хромосому — метилирование промоторной области гена miРНК, II путь). В цитоплазме: VI — функционирование miРНК, как и siРНК, в составе РНК-индуцируемого сайленсинг-комплекса (RISС), который включает Diser, белковые домены Аgo, Nuclease (РНКазу III), а также другие неидентифицированные компоненты и осуществляет деградацию и дробление матричной РНК (mРНК); VII — действие siРНК, образующейся из dsРНК, подобное эффекту miРНК. Aналогично тому, что указано на рис. А, siРНК (рис. Б) включается в RISС, который с приобретением компетентности находит соответствующее звено mРНК и подвергает ее деградации.

экспрессировали РНК, что свидетельствовало о транскрипционном сайленсинге. Отметим, что трансгенная РНК в отличие от эндогенной защищена от РНKазы. Сайленсинг наблюдали при всех использованных методах введения трансгенных копий. Эти данные интерпретируются как транскрипционный сайленсинг трансгенов.

Конструкция коллагеновый промотор — САТ при введении в клетку также вызывает быстрое исчезновение эндогенной РНК, но в этом случае сохраняется экспрессия самого репортерного гена. Такие конструкции с различным потенциалом промоторов одинаково проявляют себя в сайленсинге эндогенной РНК. То есть посттранскрипционный сайленсинг определяют последовательности в протеинкодирующей части трансгена (27).

При косупрессии генов наблюдается сайленсинг двух типов. Когда эндогенная последовательность гомологична РНК-кодирующей области трансгена, происходит нормальная транскрипция и сайленсинг проявляется как посттранскрипционный феномен (по всей видимости, как последствие РНК-превращений). Другой тип сайленсинга отмечается при гомологии трансгена и эндогена по промоторным участкам, где происходит метилирование нуклеотидных остатков и, как следствие, явное подавление транскрипции (17).

При репрессии и дерепрессии эндогенных генов, важных для программ развития у животных и растений, проявляется ключевая роль miРНК, представляющих собой довольно большой класс малых 19-22-нуклеотидных некодирующих РНК. Эти РНК также обеспечивают защиту клеток от вирусов. Экспрессию miРНК отмечали в онтогенезе у растений (Arabidopsis), червей (C. elegans), дрозофили мышей. Это может быть следствием присутствия временных регуляторных элементов в промоторах генов miРНК, как это было показано для let-7 miРНК у C. elegans (S. Johnson e.a., 2003;цит. по ссылке 24). Около 100 потенциальных miРНКв настоящее время идентифицируется у дрозофилы, ленточных червей и лабораторных млекопитающих (M. Lagos-Quintana e.a., 2001; N. Lau e.a., 2001; R. Lee e.a., 2001; цит. по ссылке 24). Хотя их функция до конца не ясна, видимо, таким образом hpРНК-предшественник преобразуется в зрелую интерференционную РНК, участвующую в периодизации развития органов и тканей. Отмечено, что РНК с 2-3 нуклеотидами на 3′-концах более эффективно снижают количество мРНК, чем siРНК с «тупыми» концами (S. Elbashir e.a., 2001).

Эволюционно сформировавшийся механизм генного молчания, реализуемый через малые РНК, представляет собой новую парадигму регуляции генной активности у эукариотов, а также не известную ранее систему защиты организмов от чужеродных генетических элементов.

М е х а н и з м   с а й л е н с и н г а. Ключевым звеном в процессинге dsРНК служит Дисер-энзиматическая активность, относящаяся к функциям семейства рибонуклеаз (RNase III). Е. Berrnstein с соавт. (2001) обнаружили, что существует два вида ферментной активности, легко различимых во фракциях, получаемых при высокоскоростном центрифугировании образцов. Первая (выявляется в супернатанте) — Дисер-энзиматическая активность, которая определяет расщепление dsРНК до siРНК, вторая (обнаруживается в осадке) — активность, ассоциированная с РНК-индуцированным сайленсинг-комплексом (RISC), которая обусловливает расщепление считываемой мРНК. Обращение dsРНК в siРНК и RISC-опосредованное расщепление целевой мРНК представляют собой соответственно инициаторный и эффекторный этапы РНК-интерференции (21). Обнаружен также Дисер-подобный протеин (DCL1), ответственный за АТФ-зависимое расщепление двуцепочечной РНК как в ядре, так и в цитоплазме многоклеточных организмов. В результате процессинга dsРНК образуются короткие двойные цепочки siРНК либо miРНК. В последнем случае Дисер-дробление соответствующих dsРНК происходит в ядре при считывании кодовых последовательностей так называемых промежуточных зон растительных и животных геномов (24) (см. рис., I путь). Некоторые малые РНКиндуцируют активность целевых промоторов эндогенных генов (W. Park e.a., 2002; цит. по ссылке 24) (см. рис., II путь).

При считывании нерегулярных ДНК трансгенов и/или транспозонов синтезируются инвертированнные транскрипты в виде hpРНК, которые формируют комплекс с DCL1. Образующиеся в результате продукты фрагментации блокируют транскрипционную активность соответствующих участков хромосом. Такое эпигенетическое регулирование изменяет наследственные свойства, не затрагивая, однако, первичную структуру ДНК, изменения в которой возможны при более глубоких модификациях хроматина (в обсуждаемом случае происходит в основном деацетилирование гистонов и метилирование цитозин-гуаниновых групп ДНК в так называемых CpG-островках, вследствие чего хроматин переходит в пассивное состояние). Эпигенетические эффекты Дисер-активности генетических медиаторов, репрессирующих генные единицы, оцениваются как своего рода функциональные ответы клеток на внешние воздействия. Плотность СрG-последовательностей в транскрибируемой области трансгена коррелирует со степенью подавления транскрипции. Считают, что в геноме CpG-участки распределены неравномерно, и их примерное содержание — около 1 %, то есть около 30 000 коротких участков, богатых CpG (29). Метилирование цитозиновых остатков в CpG-динуклеотидах представляет собой основу механизма эпигенетического контроля генной экспрессии у позвоночных. Сигнал для метилирования пока не известен, но показано, что повторы в молекуле ДНК проявляют сродство к ДНК-метилазам. ДНК-метилированию подвержены повторяющиеся геномные последовательности независимо от их транскрипционной активности (30).

Трансгены часто создаются с использованием регуляторных элементов неродственных геномов. При этом (наряду с успешным применением промоторов широко распространенных генов) имеются примеры обескураживающего снижения экспрессии. В подобных случаях наблюдается метилирование ДНК в промоторных участках, богатых СрG-островками, и функциональное блокирование введенной конструкции. Метилирование промоторного участка ведет к транскрипционному сайленсингу, области смысловых кодонов — к посттранскрипционному.

После описанных преобразований в ядре клетки siРНК поступает в цитоплазму, где также накапливаются аберрантные мРНК и шпилечные РНК (hpРНК). Их процессинг происходит с участием специфических белков-катализаторов из семейств Ago и Rdp — Аргонавт и РНК-зависимая РНК-полимераза.

На завершающей стадии РНК-интерференции функционирует РНК-индуцированный сайленсинг-комплекс (RISC). Одна из цепей входящего в его состав дуплекса siРНК используется в качестве шаблона, другая расщепляется, после чего комплекс активируется, приобретая способность разрушать считываемую мРНК (31). В него, кроме антисенс-РНК, входят Дисер, dsРНК-связанный протеин (TRBP) и белковый катализатор Аргонавт 2. Важно, что для процессинга miРНК, а также сборки RISC и распада мРНК АТФ не требуется (27).

Описано подавление транскрипции с участием так называемых гетерохроматиновых siРНК, которые вовлечены в эпигенетические взаимодействия и возникают из перекрывающихся транскриптов центромерно расположенных ретротранспозонов или других нерегулярных повторов (В. Reinhart and D. Bartel, 2002; цит. по ссылке 17). Подобные индуцируемые при РНК-интерференции изменения гетерохроматина служат адекватным средством регуляции генной экспрессии, поведения и эволюции хромосом (32). Такие РНКi-зависимые модификации гистонов и ДНК могут «запоминаться» и воспроизводиться, сохраняясь при клеточном делении и оплодотворении. Описанное явление относят к категории импринтинга (когда генная экспрессия подконтрольна свойствам родительских хромосом) и рассматривают как эпигенетический механизм генного сайленсинга у растений и животных. Так, М. Kearns с соавт. (2000) сообщают, что интродукция чужеродной ДНК в геном млекопитающих через транспозоны и трансгены оказывается связанной с родительским импринтингом, эффект которого чаще всего сохраняется в процессе мейоза (33). Заложенная специфика импринта обусловлена изменениями в метилировании ДНК гистонов.

Наконец, важная особенность событий, связанных с интерференционными РНК, дающая основание считать этот механизм эволюционно значимым для жизнеобеспечения клетки, заключается в системности сайленсинга, которая выявлена у растений и беспозвоночных животных. Сигнал сайленсинга, в роли которого выступает siРНК, передается от клетки к клетке и проникает в васкулярную систему, индуцируя сиквенс-специ-фический сайленсинг в отстоящих сайтах. Насколько запрограммирован подобный обмен siРНК у высших млекопитающих, еще предстоит детально изучить.

Итак, рассмотренные результаты представляют собой новый этап в исследовании процессов интеграции чужеродной ДНК в геном хозяина и механизмов защиты консервативной генетической конституции последнего. Эти данные свидетельствуют о перспективности работ по генной инженерии животных, однако указывают на необходимость поиска действительно эффективных способов трансгенеза, исключающих этап преобразования двуцепочечных РНК в клетке, который приводит к интерференции гомологичных РНК и молчанию интегрированных генов. Можно сказать, что в настоящее время так называемая РНК-интер-ференция представляет собой весьма острую проблему на пути развития биотехнологии трансгенеза. Успех ее решения обещает прорыв в науке и практике современного животноводства.

Л И Т Е Р А Т У Р А

1. Э р н с т  Л.К. Проблемы селекции и биотехнологии сельскохозяйственных животных. М., 1995.
2. Э р н с т  Л.К.,  Ш и х о в  И.Я.,  З и н о в ь е в а  Н.А. и др. Морфофункциональные особенности интерьера свиней, трансгенных по генам каскада гормона роста. Дубровицы, 2004.
3. В а с и л ь е в  И.М.,  В а с и л ь е в а  Т.В.,  Г е о р г и е в  Г.П. и др. Получение трансгенных свиней, содержащих и экспрессирующих ген поверхностного антигена вируса гепатита человека. ДАН СССР, 1989, 306(1): 206-209.
4. Ш и х о в  И.Я.,  Э р н с т  Л.К.,  Н е к р а с о в  А.А. и др. Получение трансгенных свиней. В сб.: Генно-инженерные сельскохозяйственные животные. М., 1995.
5. З и н о в ь е в а  Н.А.,  Э р н с т  Л.К. Проблемы биотехнологии и селекции сельскохозяйственных животных. М., 2004.
6. П а р х о м е н к о  Е.Г. Сравнительное исследование свиней, трансгенных по GHRF, 3-го и 9-го поколений. Канд. дис., Дубровицы, 2007.
7. P a l m i t e r  R.D.,  B r i n s t e r  R.l.,  H a m m e r  R.E. e.a. Dramatic growth of mice that develop from eggs microinjected with metallothionein-growth hormone fusion gene. Nature, 1982, 300: 611-615.
8. B r e m  G.,  W a n k e  R.,  W o l f  E.E. e.a. Multiple consequences of human growth hormone expression in transgenic mice. Mol. Biol. Med., 1989, 6: 531-547.
9. B r e n i g  B.,  B r e m  G. Genetic engineering approaches to pig production. Reprod. Dom. Anim., 1991, 26: 14-21.
10. L a v a n i a  U.C.,  L a v a n i a  S.,  V i m a l a  Y. Targeted transgene integration: the way ahead to stable transformation. Cur. Sci., 1998, 75(8): 759-760.
11. C l a r k  A.J.,  H a r o l d  G.,  Y u l l  F.E. Mammalian cDNA prokaryotic and reporter sequences silence adjacent transgenes in transgenic mice. Nucl. Acids Res., 1997,25(5): 1009-1014.
12. D o b i e  K.,  M e h t a l i  M.,  Mc C l e n a g h a n  M. e.a. Variegated gene expression in mice. Trends Genet., 1997, 4: 127-130.
13. O p s a h l  M.L.,  Mc C l e n a g h a n  M.,  S p r i n g b e t t  A. e.a. Effects of genetic background on variegated transgene expression in mice. Genetics,2002,160: 1107-1112.
14. H e n i k o f f  S. Conspiracy of silence among repeated transgenes. BioEssays, 1998, 20: 532-535.
15. B i r c h l e r  J.A.,  B h a d r a  M.P.,  B h a d r a  U. Making noise about silence: repression of repeated genes in animals. Curr. Opin. Genet. Dev., 2000, 10(2): 211-216.
16. M a r t i n  D.I.K.,  W h i t e l a w  E. The vagaries of variegating transgenes. BioЕssays, 1996, 18(11): 919-923.
17. B i r c h l e r  J.,  P a l-B h a d r a  M.,  B h a d r a  U. Transgene cosupression in animals. In:RNAi: a guide to gene silencing /G. Hannon (ed.). Cold Spring Harbor, US, 2003: 23-42. 
18. G a r r i c k  D.,  F i e r i n g  S.,  M a r t i n  D.I. e.a.Repeat-induced gene silencing in mammals. Nat. Genet., 1998, 18: 56-59.
19. T h a k u r  A. RNA interference revolution. Electron. J. Biotechnol., 2003, 6(1): 1-2.
20. F i r e  А.,  M e l l o  C.C. RNA interference — gene silencing by double-stranded RNA. In: The Nobel Prize in physiology or medicine for 2006. Press Release of the Nobel Assembly at Karolinska Institute, 2006.
21. S e n  G.L.,  B l a u  H. A brief history of RNAi: the silence of the genes. FASEB J., 2006, 20: 1293-1299.
22. D i a l l o  M.,  A r e n z  C.,  S c h m i t z  K. e.a. Long endogenous dsRNAs can induce complete gene silencing in mammalian cells and primary cultures. Oligonucleotides, 2003, 13(5): 381-392.
23. T u s c h l  T. Mammalian RNA interference. In: RNAi: a guide to gene silencing /G. Hannon (ed.). Cold Spring Harbor, US, 2003: 265-296. 
24. F i n n e g a n  E.G.,  M a t z k e  M.A. The small RNA world. J. Cell Sci., 2003, 116: 4689-4693.
25. P a d d i s o n  P.J.,  C a u d y  A.A.,  B e r n s t e i n  E. e.a. Short hairpin RNAs (shRNAs) induce sequence-specific silencing in mammalian cells. Gen. Devel., 2002, 16(8): 948-958.
26. Li u  Y.P.,  H a a s n o o t  J.,  B e r k h o u t  B. Design of extended short hairpin RNAs for HIV-1 inhibition. Nucl. Acids Res., 2007, 35(17): 5683-5693.
27. B a h r a m i a n  M.B.,  Z a r b l  H. Transcriptional and posttranscriptional silencing of rodent a1(I) collagen by a homologous transcriptionally self-silenced transgene. Mol. Cell. Biol., 1999, 19(1): 274-283.
28. D u d l e y  N.,  G o l d s t e i n  B. RNA interference: Silencing in the cytoplasm and nucleus. Curr. Opin. Mol. Therap., 2003, 5(2): 113-117.
29. C h e v a l i e r - M a r i e t t e  C.,  H e n r y  I. e.a. CpG content affects gene silencing in mice: evidence from novel transgenes.Genome Biol., 2003, 4(9): R53 (электронная версия).
30. P e n a  R.N.,  W e b s t e r  J.,  K w a n  S. e.a. Transgene methylation in mice reflects copy number but not expression level. Mol. Biotechnol., 2004, 26(3): 1073-1085.
31. M a t r a n g a  C.,  T o m a r i  Y.,  S h i n  C. e.a. Рassenger-strand cleavage facilitates assembly of siRNA into Ago2-containing RNAi enzyme complexes. Cell, 2005, 123(4): 543-545.
32. L i p p m a n  Z.,  M a r t i e n s s e n  R. The role of RNA interference in heterochromatic silencing. Nature, 2004, 431: 364-370.
33. K e a r n s  M.,  P r e i s  J.,  Mc D o n a l d  M. e.a. Complex patterns of inheritance of an imprinted murine transgene suggest incomplete germline. Nucl. Acids Res., 2000, 28(17): 3301-3309.
34. C h a t t o p a d h y a y a  J. Ribonucleic acid interference (RNAi). Integrated Project RNA Interference Technology as Human Therapeutic Tool (RIGHT) (LSHB-CT-2004-005276). http://www.ip-right.org/2004.

 

SMALL INTERFERING RNA AS CELL DEFENCE FROM TRANSGENЕSIS (review)

I.Ya. Shikhov

The current state of investigations is discussed on integration of foreign DNA to genome of animals or plants. The data are presented that suggested about an inhibition of expression of irregular genetic information under the influence of so-called small interfering RNA (siRNA). RNA interference (RNAi) that leads to silence of gene on transcriptional or posttranscriptional level is of great importance in cell biology as mechanism of the defense from viral, transgenic and trans-poson insertion and the periodization of functional genome activity during growth and development of organism.

Key words: transgene, DNA, RNA-interference, shRNA, mRNA degradation, Dicer complex, RISC.

 

ГНУ Всероссийский НИИ животноводства
Россельхозакадемии,

142132 Московская обл., Подольский р-н, пос. Дубровицы,
e-mail: i_shihov@mail.ru

Поступила в редакцию
6 ноября 2008 года

 

 

 

 

Оформление электронного оттиска

назад в начало