Сельскохозяйственная биология, 2009, № 4, с. 37-45.

УДК 636.2:591.392

РАЗВИТИЕ IN VITRO ПАРТЕНОГЕНЕТИЧЕСКИХ И КЛОНИРОВАННЫХ ЭМБРИОНОВ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА ПРИ РАЗНЫХ СПОСОБАХ ИСКУССТВЕННОЙ АКТИВАЦИИ ЦИТОПЛАСТОВ

В.П. РЯБЫХ, А.С. АЛГУЛЯН, А.Г. ЛОГИНОВ, К.В. КИРИЕНКО, И.Г. СМЕТАНИНА, Л.В. ТАТАРИНОВА

Изучали эффективность различных способов искусственной активации яйцеклеток крупного рогатого скота, используемых в качестве цитопластов при получении клонированных эмбрионов. Установлено, что наилучшее развитие партеногенетических и реконструированных эмбрионов до стадии бластоцисты наблюдается при активации цитопластов кальциевым ионофором. Хлористый стронций оказался малоэффективным для активации ооцитов, дозревавших in vitro до стадии метафазы II.

Ключевые слова: ооцит, цитопласт, искусственная активация, партеногенетическое развитие, клонирование животных, эмбрион, крупный рогатый скот.

Один из критических этапов технологии клонирования животных посредством трансплантации ядер соматических клеток в энуклеированные яйцеклетки — активация цитопластов в реконструированных эмбрионах, от которой зависит репрограммирование кариопластов и развитие реконструированных клеток. Трансплантированное ядро под действием факторов цитоплазмы переходит в состояние мейотической метафазы II (М II), аналогичное состоянию ядра нативной яйцеклетки, и оказывается заблокированным в нем. Чтобы в ядре реконструированной клетки началось деление дробления, клетку необходимо активировать, то есть снять мейотический блок.

У большинства видов млекопитающих овулировавшие яйцеклетки, используемые в работах по клонированию в качестве источников цитопластов, до момента оплодотворения имеют мейотический блок на стадии М II, который в ооцитах поддерживается за счет высокой активности фактора, способствующего созреванию (maturation promoting factor, MPF) (1, 2). MPF представляет собой комплекс, состоящий из двух субъединиц: каталитической — p34cdc2 и регуляторной — циклина Б (3, 4). Высокая активность MPF проявляется в распаде ядерной оболочки, конденсации хромосом и формировании веретена мейотического деления. Стабильная активность MPF в ооците поддерживается действием цитостатического фактора (cytostatic factor, CSF), который предотвращает убиквитин-зависимую деградацию циклина Б и, тем самым, инактивацию MPF (1).

В естественных условиях активация яйцеклетки происходит при оплодотворении, когда сперматозоид, проходя через цитоплазматическую мембрану, запускает серию внутриклеточных колебаний концентрации ионов кальция (Са²⁺); эти колебания координируют  процессы, необходимые для завершения мейоза, возобновления клеточного цикла и начала развития эмбриона (5-8). Повышение и колебания концентрации Са2+, индуцированные сперматозоидом в ооцитах, приводят к разрушению CSF, деградации циклина Б и в конечном итоге — к инактивации MPF. Протеолитическая деградация циклина Б и последующая инактивация MPF позволяют ооцитам преодолеть блок метафазы II и начать митотический цикл деления (9).

Оказалось, что вызывать изменение концентрации Са2+ внутри яйцеклетки может не только сперматозоид, но и искусственные активаторы — электроимпульс, этанол, кальциевый ионофор и ряд других агентов. При воздействии на цитоплазматическую мембрану эти факторы вызывают однократное неконтролируемое повышение концентрации Са2+ в цитозоле, индуцирующее активацию ооцита и его партеногенетическое развитие. При этом (так же, как при оплодотворении) происходит экзоцитоз кортикальных гранул и формирование пронуклеусов (10, 11).

Показано, что частота и кратность колебаний концентрации кальция играют важную роль в процессе активации. В том случае, когда ооциты млекопитающих подвергаются стимуляции, в большей степени имитирующей колебания концентрации кальция, вызванные сперматозоидом при оплодотворении, наблюдается увеличение числа активированных ооцитов и улучшение качества полученных бластоцист (12). Установлено, что длительное неконтролируемое поступление кальция в цитозоль в значительной степени снижает жизнеспособность ооцитов грызунов (13). Отмечалось цитотоксическое действие ионов кальция, если их содержание в ооцитах животных оставалось высоким в течение продолжительного времени (14). Кроме того, колебания концентрации Са²⁺ с несоответствующей частотой вызывают остановку в развитии эмбриона (14).

Поскольку неконтролируемое повышение концентрации Са²⁺ в яйцеклетках может вызывать цитотоксический эффект, ведется поиск режимов искусственной активации цитопласта, близких по механизмам к процессам, вызываемым сперматозоидом при оплодотворении.

При активации нативной яйцеклетки партеногенетическое развитие происходит в результате деления собственного ядра, в то время как в реконструированных клетках — в результате репрограммирования чужеродного. Репрограммирование генома соматических клеток — сложнейший процесс, включающий последовательное действие ряда механизмов. Поэтому можно предположить, что для эффективной искусственной активации цитопласта необходимо более строгое приближение к режиму, создаваемому сперматозоидом при оплодотворении.

Целью наших исследований была оценка влияния различных факторов искусственной активации на развитие партеногенетических и реконструированных эмбрионов крупного рогатого скота, полученных при использовании дозревавших in vitro ооцитов в качестве цитопластов и ядер соматических клеток взрослых животных — в качестве кариопластов.

Методика.Объектомисследования были ооциты крупного рогатого скота,дозревавшие in vitro, которые использовали для партеногенетической активации и в качестве цитопластов при реконструировании эмбрионов.

П о л у ч е н и е   я й ц е к л е т о к   к р у п н о г о   р о г а т о г о 
с к о т а   i n   v i t r o. Яичники от коров и телок получали на мясокомбинате и транспортировали в лабораторию в течение 1-2 ч при температуре 30 °С в фосфатно-солевой среде Дюльбекко («ПанЭко», Россия). Ооциты выделяли из антральных фолликулов диаметром 2-6 мм методом рассечения. Для эксперимента отбирали ооциты с многослойным компактным кумулюсом. Созревание ооцитов проводили в среде МЕМ-альфа («Sigma», США). В среду созревания добавляли фолликулостимулирующий гормон (ФСГ) («ФСГ-супер», ООО «Агробиомед», ВНИИФБиП сельскохозяйственных животных, Россия) в концентрации 1 мкг/мл и хорионический гонадотропин человека (ХГч, Московский эндокринный завод) в концентрации 0,3 ед/мл. Помимо гормонов, вводили пируват натрия («Sigma», США) и  глутамин («Sigma», США) до концентрации соответственно 0,2 и 2,0 мМ, а также 100 ед. пенициллина и 100 мкг стрептомицина («ПанЭко», Россия) на 1 мл среды. Ооциты культивировали в 4-луночных чашках («Nunc», Дания) по 50 кумулюс-ооцитных комплексов (КОК) на лунку с 500 мкл среды при температуре 38,5 °С в атмосфере 5 % СО₂ в воздухе в течение 20-22 ч, после чего удаляли клетки кумулюса и отбирали для дальнейшей работы ооциты с выделившимся первым полярным тельцем (стадия M II). Часть ооцитов служила контролем на полноценность созревания — их оплодотворяли и культивировали до стадии бластоцисты.

Р е к о н с т р у и р о в а н и е   э м б р и о н о в   т р а н с п л а н -т а ц и е й   я д е р   в   э н у к л е и р о в а н н ы е   я й ц е к л е т к и. При реконструировании эмбрионов в качестве кариопластов использовали свежеполученные клетки кумулюса размером 10-12 мкм округлой формы, большая часть которых в этот период находится в фазе G0-G1 клеточного цикла (15).

Энуклеацию ооцитов и реконструирование клеток выполняли микрохирургическим методом (16) на установке, состоящей из комплекта микроманипуляторов («Narishiga», Япония) и инвертированного микроскопа Diaphot-TMD («Nikon», Япония), оснащенного оптикой дифференциально-интерференционного контраста (DIC по Номарскому). Микрохирургические манипуляции проводили в камере типа Фонбрюна. Предварительно группу ооцитов инкубировали в течение 30 мин в манипуляционной среде Тироде-HEPES (Т-Н), содержащей цитоскелетный ингибитор — цитохалазин Б в концентрации 7,5 мкг/мл. При реконструировании единичные кумулюсные клетки (кариопласты) вводили в перивителлиновое пространство энуклеированных ооцитов через прокол в блестящей оболочке.

Слияние цитопласта с кариопластом осуществляли с помощью контроллера электрослияния (Институт биологического приборостроения РАН, г. Пущино) в камере с параллельными электродами в среде Циммермана (17) при подаче одного прямоугольного импульса постоянного тока (напряжение — 2,0 кВ/см, продолжительность — 30 мкс).

Активацию реконструированных клеток выполняли через 1,0-1,5 ч после установления факта электрослияния. Реконструированные клетки и интактные ооциты были распределены на группы и подвергнуты различным вариантам активации.

В первой серии опытов у ооцитов крупного рогатого скота, дозревавших in vitro, определили эффективность активации партеногенетического развития факторами, которые наиболее часто используются для искусственной активации яйцеклеток млекопитающих. В I группе применяли однократный прямоугольный импульс постоянного тока (напряжение 0,8-1,2 кВ/см, продолжительность 30 мкс, камера с параллельными электродами) в среде Циммермана (0,3 мМ маннитол, 0,1 мМ МgSO₄, 0,05 мM СаCl₂) (17); во II группе — 7 % этанол в манипуляционной среде T-H в течение 5 мин; в III группе — кальциевый ионофор А23187 (10 мкМ) в манипуляционной среде T-H в течение 5 мин. После активации все яйцеклетки культивировали в среде КSOM, содержащей 6-диметиламинопурин (6-DMAP, 2 мМ) для предотвращения восстановления комплекса MPF и перехода в состояние новой метафазы мейоза — так называемой метафазы III (18, 19).

Активацию ооцитов крупного рогатого скота с применением хлористого стронция (через 23-24 ч после постановки на дозревание) проводили культивированием в среде KSOM без ионов Ca²⁺ и Mg²⁺, содержащей 10 мM, 20 мM и 30 мM SrCl₂ и 5 мкг/мл цитохалазина Б, в течение 6 ч (соответственно IV, V и VI группы).

Реконструированные и партеногенетически активированные эмбрионы крупного рогатого скота культивировали в среде КSOM, обогащенной незаменимыми и заменимыми аминокислотами (КSOMАА). В течение первых 48 ч эмбрионы помещали в среду, обогащенную 4 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (BSA), затем — 10 % эмбриональной сыворотки теленка (FCS). Культивирование эмбрионов проводили в микрокаплях под слоем минерального масла в увлажненной атмосфере под газовой фазой 5 % CO₂, 5 % O₂ и 90 % N₂ в течение 10 сут при 38,5 °С (10-12 эмбрионов на одну каплю объемом 50-60 мкл). Через каждые 48 ч эмбрионы переносили в капли свежей среды и регистрировали процесс развития.

Статистическую обработку проводили с помощью программы ANO-VA. Достоверность эффектов оценивали с использованием t-критерия.

Результаты. Для первичного определения факторов и режимов активации цитопластов, используемых при реконструировании эмбрионов млекопитающих, обычно вызывают партеногенетическую активацию яйцеклеток, так как эта методика менее трудоемка и в большинстве случаев дает достаточно объективные результаты.

Эффективность активации яйцеклеток крупного рогатого скота этанолом (II группа) и кальциевым ионофором (III группа) с последующей 4-часовой обработкой 6-DМАР была примерно одинаковой (табл.). В деление дробления в этих группах вступило соответственно 55,3 и 60,5 % яйцеклеток, а до стадии бластоцисты развилось 16,3 и 23,1 % эмбрионов. При культивировании отмечалось более медленное развитие яйцеклеток, которые активировали этанолом (II группа), по сравнению с активированными кальциевым ионофором (III группа). При этом выход бластоцист из блестящей оболочки наблюдали только у эмбрионов III группы. Активация яйцеклеток крупного рогатого скота однократным прямоугольным импульсом постоянного тока (I группа) оказалась менее эффективной (13,8 %).

Можно предположить, что различия, наблюдаемые в развитии эмбрионов до стадии бластоцисты при использовании различных активирующих факторов, в значительной степени обусловлены механизмами поступления Ca2+ в цитозоль.
Так, установлено, что при партеногенетической активации яйцеклеток млекопитающих этанол вызывает однократное повышение концентрации Ca²⁺ в цитозоле за счет как притока внеклеточного Ca²⁺ вследствие увеличения проницаемости мембран ооцита (20), так и высвобождения небольшого количества Ca²⁺ из внутриклеточных депо (21). Наши исследования на мышиных эмбрионах, реконструированных посредством трансплантации ядер клеток кумулюса в энуклеированные яйцеклетки, показали, что экзогенный кальций оказывает существенное влияние на эффективность активации цитопластов этанолом и последующее развитие эмбрионов до стадии бластоцисты in vitro. Эффективность действия только эндогенного Ca²⁺ была достоверно ниже, чем эндогенного совместно с экзогенным (22).

При активации нативных и реконструированных яйцеклеток млекопитающих с помощью прямоугольного импульса постоянного тока происходит пробой цитоплазматической мембраны яйцеклетки с образованием пор, через которые экзогенный Са²⁺ по градиенту концентрации поступает в цитоплазму (21). Наши исследования на мышиных яйцеклетках продемонстрировали, что при таком воздействии как на интактные яйцеклетки, так и на реконструированные эмбрионы экзогенный Ca2+ играет основную роль в процессе активации и последующем развитии эмбрионов до стадии бластоцисты in vitro (23). При этом как в среде с Ca²⁺, так и без Ca²⁺ эффективность активации прямоугольным импульсом постоянного тока была несколько ниже, чем этанолом (22, 23). Этот факт, по-видимому, можно объяснить тем, что через поры, образовавшиеся при пробое мембраны, увеличивается неконтролируемое поступление экзогенного Ca²⁺ в клетку (как уже отмечалось, чрезмерное повышение концентрации Ca²⁺ в цитозоле может вызвать ее гибель) (13, 14). Ранее сообщалось о ведущей роли экзогенного Ca²⁺ при активации к партеногенетическому развитию яйцеклеток кроликов и свиней с применением прямоугольного импульса постоянного тока (24, 25).

В наших исследованиях, выполненных на мышиных яйцеклетках, у которых партеногенетическое развитие активировали кальциевым ионофором, было обнаружено, что повышение концентрации кальция в цитозоле происходит за счет высвобождения из внутриклеточных депо ооцитов, а экзогенный кальций, находящийся в среде активации, не оказывает влияния на ее эффективность и последующее развитие эмбрионов (26). Аналогичные результаты мы получили на мышиных эмбрионах, реконструированных трансплантацией ядер клеток кумулюса в энуклеированные яйцеклетки, при активации кальциевым ионофором (26).

Таким образом, физиологически наиболее приемлемым способом активации яйцеклеток крупного рогатого скота служит обработка кальциевым ионофором (А23187) с последующим культивированием в растворе 6-DMAP в течение 3-4 ч. В отличие от применения этанола или прямоугольного импульса постоянного тока, при котором ведущую роль играет экзогенный Ca²⁺, в этом варианте основную функцию выполняет эндогенный Ca²⁺ внутриклеточных депо. При искусственной активации реконструированных клеток увеличение концентрации эндогенного Ca²⁺ в цитозоле предпочтительнее, так как его высвобождение — более стабильный и физиологичный процесс, чем неконтролируемое поступление экзогенных ионов в клетку из культуральной среды.

В последние годы внимание исследователей также привлекает хлористый стронций (SrCl₂), который ранее использовался для партеногенетической активации мышиных яйцеклеток (27, 28). Установлено, что в отличие от большинства активаторов партеногенетического развития, которые обусловливают однократное повышение концентрации Ca²⁺ в цитозоле яйцеклетки, хлористый стронций вызывает регулярно повторяющиеся колебания этого показателя, в большинстве своем сходные по динамике с наблюдаемыми при оплодотворении сперматозоидом. Было отмечено, что активация хлористым стронцием обеспечивает хорошее предымплантационное развитие партеногенетических эмбрионов крыс (29). Однако сходство в изменении содержания Ca²⁺ в цитозоле клетки под действием сперматозоида и хлористого стронция не абсолютное. Исследования на яйцеклетках крысы показали, что при обработке SrCl₂ происходит первое мощное высвобождение кальция, которое затем сопровождается более длительными колебаниями концентрации, причем с более низкой частотой и амплитудой, чем у вызванных сперматозоидом (30).

Несмотря на достаточно многочисленные положительные результаты при партеногенетической активации яйцеклеток лабораторных животных с помощью SrCl₂, в настоящее время очень мало информации о том, как влияет SrCl₂ на эффективность активации и дальнейшее развитие партеногенетических и реконструированных эмбрионов сельскохозяйственных животных. В этой связи в следующей серии экспериментов мы оценили возможность активации ооцитов крупного рогатого скота хлористым стронцием.

Как оказалось (см. табл.), яйцеклетки крупного рогатого скота, дозревавшие in vitro до стадии М II, плохо активируются хлористым стронцием во всех испытанных концентрациях (в отличие от мышиных яйцеклеток, созревавших in vivo, — соответственно 8-23 против 92-95 %). При этом дальнейшее развитие до стадии бластоцисты у активированных яйцеклеток крупного рогатого скота происходило значительно хуже, чем у мышиных яйцеклеток (соответственно 1,8-7,5 против 76,0-82,0 %).

В предварительных экспериментах, выполненных нами на мышиных яйцеклетках, было установлено, что обработка SrCl₂ в концентрации 10 мM в течение 3-6 ч активирует партеногенетическое развитие у 92-95 % яйцеклеток, из которых 76-82 % достигают стадии бластоцисты. При воздействии хлористого стронция на мышиные эмбрионы, реконструированные посредством трансплантации ядер клеток кумулюса в энуклеированные яйцеклетки, в деление дробления вступило 88,5 %, стадии бластоцисты достигло 34,6 %.

Таким образом, испытанные варианты активации ооцитов крупного рогатого скота хлористым стронцием не могут быть рекомендованы для использования в технологии клонирования эмбрионов крупного рогатого скота.

Аналогичные низкие результаты партеногенетической активации ооцитов крупного рогатого скота хлористым стронцием были получены другими исследователями (31). Кроме того, эксперименты показывают, что чувствительность ооцитов к действию стронция зависит от вида животного: если у мышей и крыс отмечается высокая эффективность активации, то у крупного рогатого скота (31) и свиней (32) — низкая, а у китайского хомячка она вообще отсутствует (33). Можно предположить, что эти видовые различия обусловлены преобладающим в яйцеклетках типом инозитол-1,4,5-трисфосфат-рецепторов (inositol 1,4,5-trisphosphate receptor, InsP3-R). Как установлено, SrCl₂ активирует Ca²⁺-связывающий участок на InsP3-R (34), поэтому SrCl₂-опосредованные колебания концентрации Ca²⁺ осуществляются через эти рецепторы (35, 36), что ведет к периодическому высвобождению Ca²⁺ и обусловливает более длительный период активации.

Известно три типа изоформ InsP3-R, которые экспрессируются с различной степенью интенсивности в разных типах клеток. Показано, что в мышиных яйцеклетках преобладает I тип InsP3-R (37). Возможно, хлористый стронций лучше связывается и активирует Ca²⁺-связывающие сайты на InsP3-R I типа, в результате чего более эффективно активирует мышиные яйцеклетки. Не исключено, что в яйцеклетках крупного рогатого скота преобладают InsP3-рецепторы других изоформ.

В последующих экспериментах для активации цитопластов в реконструированных эмбрионах крупного рогатого скота нами был использован наиболее эффективный и более физиологичный режим — обработка кальциевым ионофором (5 мин) + 6-DMAP (4 ч), так как он позволил получить наибольшую долю партеногенетических эмбрионов, развившихся до стадии бластоцисты (см. табл.). При таком способе активации цитопластов в эмбрионах крупного рогатого скота, реконструированных с использованием в качестве кариопластов клеток кумулюса (n = 403, эффективность слияния 43,7±3,2 %, или 176 из 403), в деление дробления вступило 54,0±5,8 % реконструированных эмбрионов (n = 95), до стадии морулы развилось 27,8±4,3 % (n = 49), до стадии бластоцисты — 17,6±2,9 % (n = 31). Ранее мы сообщали о получении 20,3-23,6 % клонированных эмбрионов крупного рогатого скота на стадии бластоцисты при активации реконструированных клеток кальциевым ионофором, но при других условиях культивирования (38).

Итак, наиболее приемлемым способом активации реконструированных эмбрионов крупного рогатого скота служит обработка кальциевым ионофором А23187 в течение 5 мин с последующим культивированием в растворе 6-диметиламинопурина (6-DMAP, 2 мM) в течение 3-4 ч. Этот прием позволяет получать до 17,6 % клонированных эмбрионов крупного рогатого скота на стадии бластоцисты из клеток, реконструированных с использованием ядер кумулюсных клеток в качестве кариопластов и яйцеклеток, дозревавших in vitro, — в качестве цитопластов. Испытанные варианты обработки ооцитов крупного рогатого скота хлористым стронцием не обеспечивают достаточную эффективность партеногенетического развития эмбрионов до стадии бластоцисты и не могут быть рекомендованы для использования в технологии клонирования эмбрионов крупного рогатого скота.

Л и т е р а т у р а

1. M a s u i  Y. The role of Cytostatic Factor (CSF) in the control of oocyte cell cycles — a summary of 20 years of study. Dev. Growth Differ., 1991, 33: 543-551.
2. K i k u c h i  K.,  N a i t o  K.,  N o g u c h i  J. e.a. Maturation M-phase promoting factor: a regulator of aging in porcine oocytes. Biol. Reprod., 2000, 63: 715-722.
3. N i x o n  V.L.,  M c D o u g a l l  A.,  J o n e s  K.T. Ca++ oscillations and the cell cycle at fertilization of mammalian and ascidian eggs. Biology of the Cell, 2000, 92: 187-196.
4. C a r r o l l  J. The initiation and regulation of Ca++ signaling at fertilization in the mammals. Seminars in Cell and Developmental Biology, 2001, 12: 37-43.
5. C u t h b e r t s o n  K.S.R.,  W h i t t i n g t h a m  D.G.,  C o b b o l d  P.H. Free Ca++ increases in exponential phase during mouse oocyte activation. Nature, 1981, 294: 754-757.
6. M i y a z a k i  S. Cell signalling at fertilization of hamster eggs. J. Reprod. Fert. Suppl., 1990,  42: 163-175.
7. T a y l o r  C.T.,  L a w r e n c e  Y.M.,  K i n g s l a n d  C.R. e.a. Oscillations in intracellular free calcium induced by spermatozoa in human oocytes at fertilization. Hum. Reprod., 1993, 8: 2174-2179.
8. D u c i b e l l a  T.,  H u n e a u  D.,  A n g e l i c h i o  E. e.a. Egg-to-embryo transition is driven by differential responses to Ca++ oscillation number. Dev. Biol., 2002, 250: 280-291.
9. L o r c a  T.,  C r u z a l e g u i  F.H.,  F e s q u e t  D. e.a. Calmodulin-dependent protein kinase II mediates inactivation of MPF and CSF upon the fertilization of Xenopus eggs. Nature, 1993, 366(6452): 270-273.
10. Y a n a g i m a c h i  R. Mammalian fertilization. In: The physiology of reproduction /E. Knobil, J.D. Neill (eds.). N.Y., 1994: 261-268.
11. L o i  P.,  L e d d a  S.,  F u l k a  J. e.a. Development of parthenogenetic and cloned ovine embryos effect of activation protocols. Biol. Reprod., 1998, 58: 1177-1187.
12. O z i l  J.P.,  H u n e a u  D. Activation of rabbit oocytes: the impact of the Ca++ signal regime on development. Development, 2001, 128: 917-928.
13. I z a n t  J.G. The role of calcium during mitosis. Calcium participates in the anaphase trigger. Chromosoma, 1993, 88: 1-10.
14. G o r d o  A.,  R o d r i g u e s  P.,  K u r o k a w a  M. e.a. Intracellular calcium oscillations signal apoptosis rather than activation in in vitro aged mouse eggs. Biol. Reprod., 2002, 66: 1828-1837.
15. S c h u e t z  A.W.,  W h i t t i n g h a m  D.G.,  S n o w d e n  R. Alterations in the cell cycle of mouse cumulus granulose cells during expansion and mucification in vivo and in vitro. Reprod. Fertil. Dev., 1996, 8: 935-943.
16. M c G r a t h  J.,  S o l t e r  D. Nuclear transplantation in the mouse embryos. J. Exp. Zool., 1983, 228: 355-362.
17. Z i m m e r m a n n  V.,  V i e n k e n  J. Electric field-induced cell-to-cell fusion. J. Membrane Biol., 1982, 67: 165-182.
18. K u b i a k  J.Z. Mouse oocytes gradually develop the capacity for activation during the metaphase II arrest. Dev. Biol., 1989, 136: 537-545.
19. K u b i a k  J.Z.,  W e b e r  M.,  d e  P e n n a r t  H. e.a. The metaphase II arrest in mouse oocytes is controlled through microtubule-dependent destruction of cyclin B in the presence of CSF. EMBO J., 1993, 12: 3773-3778.
20. C u t h b e r t s o n  K.S.R.,  C o b b o l d  P.H. Phorbol ester and sperm activate mouse oocytes by inducing sustained oscillations in cell Ca++. Nature, 1985, 316: 541-542.
21. S h i i n a  Y.,  K a n e d a  M.,  M a t s u y a m a  K. e.a. Role of the extracellular Ca++ on the intracellular Ca++ changes in fertilized and activated mouse oocytes. J. Reprod. Fertil., 1993, 97: 143-150.
22. А л г у л я н  А.С.,  Л о г и н о в  А.Г.,  К и р и е н к о  К.В. и др. Влияние различных вариантов химической активации на развитие in vitro партеногенетических и реконструированных мышиных эмбрионов. Мат. 7-й Межд. науч. конф.-школы «Современные достижения и проблемы биотехнологии с.-х. животных». Дубровицы, 2008: 64-66.
23. А л г у л я н  А.С.,  Л о г и н о в  А.Г.,  К и р и е н к о  К.В. и др. Влияние прямоугольного импульса постоянного тока и переменного электрического поля на активацию и   развитие партеногенетических и реконструированных мышиных эмбрионов. Мат. 7-й Межд. науч. конф.-школы «Современные достижения и проблемы биотехнологии с.-х. животных». Дубровицы, 2008: 67-69.
24. F i s s o r e  R.A.,  R o b l  J.M. Intracellular Ca++ response of rabbit oocytes to electrical stimulation. Mol. Reprod. Dev., 1992, 32: 9-16.
25. S u n  F.Z.,  H o y l a n d  J.,  H u a n g  X. e.a. A comparison of intracellular changes in porcine eggs after fertilization and electroactivation. Development, 1992, 115: 947-956.
26. А л г у л я н  А.С.,  Л о г и н о в  А.Г.,  К и р и е н к о  К.В. и др. Влияние осмотического давления среды активации на развитие партеногенетических и реконструированных мышиных эмбрионов in vitro. Мат. 7-й Межд. науч. конф.-школы «Современные достижения и проблемы биотехнологии с.-х. животных». Дубровицы, 2008: 70-72.
27. W a k a y a m a  T.,  P e r r y  A.C.,  Z u c c o t t i  M. e.a. Full-term development of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei. Nature, 1998, 394: 369-374.
28. K i s h i k a w a  H.,  W a k a y a m a  T.,  Y a n a g i m a c h i  R. Comparison of oocyte activating agents for mouse cloning. Cloning, 1999, 1: 153-159.
29. L a c h a m - K a p l a n  O.,  S h a w  J.,  S a n c h e z - P a r t i d a  L. e.a. Oocyte activation after intracytoplasmic injection with sperm frozen without cryoprotectants results in live offspring from inbred and hybrid mouse strains. Biol. Reprod., 2003, 69: 1683-1689.
30. J e l l e r e t t e  T.,  H e  C.L.,  W u  H. e.a. Down-regulation of the inositol 1,4,5-trisphosphate receptor in mouse eggs following fertilization or parthenogenetic activation. Dev. Biol., 2000, 223: 238-250.
31. M e o  S.C.,  L e a l  C.L.,  G a r c i a  J.M. Activation and early parthenogenesis of bovine oocytes treated with ethanol and strontium. Anim. Reprod. Sci., 2004, 81(1-2): 35-46.
32. C h e  L.,  L a l o n d e  A.,  B o r d i g n o n  V. Chemical activation of parthenogenetic and nuclear transfer porcine oocytes using ionomycin and strontium chloride. Theriogenology, 2007, 15, 67(7): 1297-304.
33. T a t e n o  H.,  K a m i g u c h i  Y. Parthenogenetic activation of Chinese hamster oocytes by chemical stimuli and its cytogenetic evaluation. Mol. Reprod. Dev., 1997, 47: 72-78.
34. M a r s h a l l  I.C.,  T a y l o r  C.W. Two calcium-binding sites mediated the interconversion of liver inositol 1,4,5-trisphosphate receptors between three conformational states. Biochem. J., 1994, 301: 591-598.
35. B r i n d  S.,  S w a n n  K.,  C a r r o l l  J.  Inositol 1,4,5-trisphosphate receptors are downregulated in mouse oocytes in response to sperm or adenophostin A but not to increase in intracellular Ca++ or egg activation. Dev. Biol., 2000, 223: 251-265.
36. Z h a n g  D.,  P a n  L.H.,  Y a n g  X.K. e.a. Strontium promotes calcium oscillations in mouse meiotic oocytes and early embryos through InsP3 receptors, and requires activation of phospholipase and synergistic action of InsP3. Hum. Reprod., 2005, 20: 3053-3061.
37. P a r r i n g t o n  J.,  B r i n d  S.,  D e  S m e d t  H. e.a. Expression of  inositol 1,4,5-trisphosphate receptors  in mouse oocytes and early embryos: the type  I isoform is upregulated in oocytes and down-regulated after fertilization. Dev. Biol., 1998, 203: 451-461.
38. К и р и е н к о  К.В.,  Л о г и н о в  А.Г.,  А л г у л я н  А.С. и др. Получение клонированных эмбрионов крупного рогатого скота с использованием ядер соматических клеток и энуклеированных ооцитов, дозревавших in vitro. С.-х. биол., 2007, 4: 53-61.

DEVELOPMENT IN VITRO OF PARTHENOGENETIC AND CLONAL CATTLE EMBRYOS AT THE DIFFERENT MODES OF ARTIFICIAL ACTIVATION OF CYTOPLASTS

V.P. Ryabykh, A.S. Algulyan, A.G. Loginov, K.V. Kirienko, I.G. Smetanina, L.V. Tatarinova

The authors studied the efficiency of different modes of artificial activation of cattle ovules used as cytoplasts during obtaining of clonal embryos. It was established, that activation of cytoplasts by calcium ionophorc result in the best development of parthenogenetic and reconstructed embryos to blastocystis stage. Strontium chloride was ineffective for activation of oocytes ripened in vitro to metaphase II stage.

Key words: oocyte, cytoplast, artificial activation, parthenogenetic development, cloning of animals, embryo, cattle.

Оформление электронного оттиска