doi: 10.15389/agrobiology.2026.3.521rus
УДК: 579.64:631.461.61:57.083.1
Исследования выполнены с использованием оборудования ЦКП «Геномные технологии, протеомика и клеточная биология» ФГБНУ ВНИИСХМ. Работы были проведены за счет финансовой поддержки гранта РНФ 23-16-00147.
ВЛИЯНИЕ СПОСОБОВ КОНСЕРВАЦИИ И ХРАНЕНИЯ НА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ И СОСТАВ МИКРОБИОМА БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОГО ПРЕПАРАТА БАГС
Т.О. ЛИСИНА✉, Г.В. ГЛАДКОВ, О.В. ОРЛОВА,
А.К. КИМЕКЛИС, А.А. КИЧКО, Е.Е. АНДРОНОВ
К настоящему времени разработаны и оптимизированы методы консервации и хранения микроорганизмов, основанные на переходе клеток в состояние анабиоза, при котором частично (хранение при пониженной температуре) или полностью (высушивание, криоконсервация) прекращаются процессы жизнедеятельности. При этом лишь немногие исследования посвящены вопросам сохранности сложных консорциумов микроорганизмов с поддержанием свойств, обеспечивающих их эффективность. Возможность проанализировать таксономический состав сложных микробных сообществ открылась с появлением методов метагеномного анализа. В настоящей работе впервые получены данные о возможности консервации стоковых образцов микробного препарата БАГС. Цель работы — испытать различные способы хранения и консервации препарата БАГС, оценить их влияние на целлюлозолитическую активность и таксономический состав прокариотического компонента консорциумов с использованием метода глубокого секвенирования ампликонных библиотек гена 16S рРНК. Работу проводили в 2023-2024 годах во Всероссийском НИИ сельскохозяйственной микробиологии (г. Санкт-Петербург). Объектами исследования были: исходный зрелый микробный препарат БАГС (первая генерация), полученный в результате компостирования в течение 6 мес торфо-соломисто-минеральной смеси и инокулюма (БАГС предыдущего приготовления); реактивированные образцы БАГС после хранения разными способами в течение 6 мес; экспериментальные партии БАГС, полученные при компостировании торфо-соломисто-минеральной смеси с использованием в качестве инокулюма реактивированных после консервации образцов препарата. Испытывали три способа хранения и консервации образцов исходного БАГС: хранение свежего препарата в холодильной камере при +4 °C; высушивание при комнатной температуре до воздушно-сухого состояния; криоконсервация (в качестве криопротектора микробных клеток добавляли глицерин до конечной концентрации 15 % и помещали в морозильную камеру при -60 °C). Спустя полгода образцы реактивировали, выдерживая при комнатной температуре в течение 1 нед, при этом предварительно высушенный увлажнили водой до 60 % от полной влагоемкости. Реактивированные образцы использовали для инокуляции торфо-соломисто-минеральной смеси при приготовлении экспериментальных партий БАГС. Для получения контрольной партии БАГС (3-я генерация) в качестве инокулюма брали свежий препарат 2-й генерации, который приготавливали по стандартной методике одновременно с хранением экспериментальных образцов. Все партии БАГС инкубировали при 28 °С в течение 5 мес. Ежемесячно двумя способами (модифицированным методом Кристенсена и аппликационным методом) оценивали целлюлозолитическую активность. Микробиологический анализ готовых 5-месячных препаратов проводили методом глубокого секвенирования ампликонных библиотек гена 16S рРНК. Количественное сравнение микробиомов осуществляли по показателям альфа- (внутри выборки) и бета-разнообразия (между выборками). Для расчета индексов альфа-разнообразия ампликонные библиотеки были нормализованы методом разрежения по минимальному размеру. Оценка альфа-разнообразия включала определение общего числа ASVs и обратного индекса Симпсона. Визуализацию бета-разнообразия проводили методом неметрического многомерного шкалирования (non-metric multidimensional scaling, NMDS) по метрике Брея-Кертиса. Эффективная партия БАГС с высокой целлюлозолитической активностью была получена с применением в качестве инокулюма реактивированного образца после высушивания. Видовое разнообразие сообществ всех трех опытных партий БАГС в 2 раза превышало контрольное. Установлено сходство представленности таксонов во всех вариантах на уровне филумов. При этом на основе показателей бета-разнообразия все сообщества различались по композиции микробного состава. Наиболее схожими оказались консорциумы контрольного препарата и БАГС, приготовленного с использованием инокулюма после высушивания. Выявлены представители микробиома — маркеры эффективного препарата, связанные с азотным обменом и расщеплением сложных полисахаридов — MND1, Methylomirabilota, Cryseolinea, Gracillibacteria.
Ключевые слова: препарат БАГС, высушивание, криоконсервация, целлюлозолитическая активность, таксономический состав, видовое разнообразие.
T.O. Lisina ✉, G.V. Gladkov, O.V. Orlova, A.K. Kimeklis,
A.A. Kichko, E.E. Andronov
Currently, methods for the preservation and storage of microorganisms have been developed and optimized, based on inducing a state of anabiosis in cells, during which vital processes are partially (storage at low temperatures) or completely (drying, cryopreservation) suspended. However, only a few studies have addressed the preservation of complex microbial consortia while maintaining the properties that ensure their effectiveness. The ability to analyze the taxonomic composition of complex microbial communities became possible with the development of high-throughput sequencing techniques/. In this study, data on the possibility of conserving stock samples of the BAGS were obtained for the first time. The study aimed to test different methods of storage and preservation of the BAGS fertilizer and to estimate their effect on cellulolytic activity and the taxonomic composition of the prokaryotic component of the consortium using deep sequencing of 16S rRNA gene amplicon libraries. The study was conducted in 2024-2025 at the All-Russian Research Institute of Agricultural Microbiology. The objects of the study were: the initial mature microbial BAGS (first generation), obtained as a result of composting a peat-straw-mineral mixture for 6 months and inoculum (previously prepared BAGS); reactivated BAGS samples after storage by different methods for 6 months; experimental batches of BAGS obtained by composting a peat-straw-mineral mixture using samples of the fertilizer fertilizer reactivated after preservation as inoculum. Three methods of storage and preservation of the initial fertilizer BAGS samples were tested: storage of the fresh fertilizer fertilizer in a refrigerator at +4 °C; drying at room temperature to an at room temperature for 1 week, during which the pre-dried samples were moistened with water to 60 % of their total water-holding capacity. The reactivated samples were used to inoculate a peat-straw-mineral mixture during the preparation of experimental BAGS batches. To obtain a control batch of BAGS (3rd generation), a fresh fertilizer h of the 2nd generation was used as inoculum; it was prepared using the standard method simultaneously with the storage of the experimental samples. All BAGS batches were incubated at 28 °C for 5 months. Cellulolytic activity was assessed monthly using two methods (the modified Christensen method and the application method). Microbiological analysis of the finished 5-month preparations was performed using deep sequencing of 16S rRNA gene amplicon libraries. Quantitative comparison of the microbiomes was carried out based on alpha- (within-sample) and beta-diversity (between-sample) indices. To calculate alpha-diversity indices, the amplicon libraries were normalized using the minimum size rarefaction method. The assessment of alpha-diversity included the determination of the total number of ASVs and the Simpson’s inverse index. Beta-diversity was visualized using non-metric multidimensional scaling (NMDS) based on the Bray-Curtis metric. An effective BAGS batch with high cellulolytic activity was obtained by using a reactivated sample after drying as the inoculum. The species diversity of the communities in all three experimental BAGS batches was twofold higher than that of the control. Similarity in taxon was observed across all variants at the phylum level. However, based on the beta-diversity indices, all communities composition differed in their microbial composition. The most comparable were the consortia of the control preparation and the BAGS fertilizer made using inoculum after drying. Representatives of the microbiome—markers of an effective fertilizer associated with nitrogen metabolism and the breakdown of complex polysaccharides—were identified: MND1, Methylomirabilota, Cryseolinea, Gracillibacteria.
Keywords: BAGS preparation, drying, cryopreservation, cellulolytic activity, taxonomic composition, species diversity.
ФГБНУ Всероссийский НИИ сельскохозяйственной |
Поступила в редакцию Принята к публикации |
