БИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ
БИОЛОГИЯ ЖИВОТНЫХ
ПЕЧАТНАЯ ВЕРСИЯ
ЭЛЕКТРОННАЯ ВЕРСИЯ
 
КАК ПОДАТЬ РУКОПИСЬ
 
КАРТА САЙТА
НА ГЛАВНУЮ

 

 

 

 

doi: 10.15389/agrobiology.2019.3.566rus

УДК 632.3.01/.08:577.15

Работа частично поддержана грантом Российского научного фонда (№ 15-14-10022).

 

ФЕРМЕНТЫ ДЕГРАДАЦИИ РАМНОГАЛАКТУРОНАНА I
КАК ФАКТОРЫ ВИРУЛЕНТНОСТИ ФИТОПАТОГЕННОЙ БАКТЕРИИ
Pectobacterium atrosepticum

Е.А. КОВТУНОВ1, В.Ю. ГОРШКОВ2, 3, Н.Е. ГОГОЛЕВА2, 3,
О.Е. ПЕТРОВА2, Е.В. ОСИПОВА2, Ч.Б. НУРИАХМЕТОВА3,
С.В. ТАТАРКИН2, Ю.В. ГОГОЛЕВ2, 3

Фитопатогенные пектобактерии (род Pectobacterium) известны как возбудители мягких (мокрых) гнилей. Симптомы мягких гнилей связаны с обширной мацерацией растительных тканей вследствие продукции микроорганизмами ферментов, разрушающих компоненты растительных клеточных стенок. Большинство ферментов, секретируемых пектобактериями, катализируют расщепление гомогалактуронана. Этот полисахарид, представляющий собой линейный гомополимер, состоит из остатков галактуроновой кислоты и является основным (по массе) пектиновым полисахаридом растительных клеточных стенок. Известно, что нокаут генов ферментов деградации гомогалактуронана приводит к снижению вирулентности пектобактерий. В то же время при инфекции, вызываемой пектобактериями, происходит модификация другого типа пектинов — рамногалактуронана I. Это разветвленный гетерополимер, остов которого построен из чередующихся остатков рамнозы и галактуроновой кислоты, а боковые цепи — из остатков галактозы или арабинозы. Однако роль пектобактериальных ферментов, разрушающих рамногалактуронан I, в развитии мягких гнилей не выявлена. Цель настоящей работы заключалась в проверке необходимости ферментов P. atrosepticum SCRI1043, разрушающих рамногалактуронан I, для полноценного развития мягких гнилей в растениях, инфицированных пектобактериями. С помощью направленного мутагенеза мы получили мутантные формы P. atrosepticum SCRI1043 по генам, кодирующим ферменты, расщепляющие рамногалактуронан I. В качестве целевых для нокаута были выбраны гены, кодирующие рамногалактуронил гидролазу (геномный локус eca3749), расщепляющую остов рамногалактуронана I, и галактаназу (геномный локус eca0852), отщепляющую боковые цепи этого полимера. Для нокаута целевых генов конструировали мутантные локусы с помощью ПЦР по методу перекрывающегося сплайсинг-расширения. Большую часть кодирующей области гена удаляли, а на ее место встраивали кассету устойчивости к канамицину. Полученную конструкцию лигировали в суицидный мобилизуемый вектор pKNG101, и сконструированную таким образом плазмиду переносили в клетки донорного штамма Escherichia coli СС118. Рекомбинантную плазмиду с мутантным локусом вводили в клетки P. atrosepticum SCRI1043, используя трехродительское скрещивание. Клоны P. atrosepticum SCRI1043, в которых проходила замена исходного локуса на мутантный и элиминация донорной плазмиды, отбирали на селективных средах. Мутантные по локусам ECA3749 и ECA0852 штаммы P. atrosepticum приводили к значительно менее интенсивному повреждению тканей растений пекинской капусты (Brassicarapa spp. pekinensis) сорта Cha Cha по сравнению с родительским штаммом дикого типа. При этом наименьшую вирулентность проявлял штамм, мутантный по локусу eca0852, кодирующему галактаназу — фермент, расщепляющий боковые цепи рамногалактуронана I. Снижение вирулентности при этом не было связано с подавлением активности ферментов, расщепляющих гомогалактуронан, или с меньшей подвижностью бактерий. Таким образом, ферменты деградации рамногалактуронана I могут быть отнесены к факторам вирулентности фитопатогенных пектобактерий, а гидролиз боковых цепей рамногалактуронана I вносит больший вклад в процесс мацерации тканей, чем разрушение остова полимера.

Ключевые слова: Pectobacterium atrosepticum, пектиновые полисахариды, рамногалактуронан I, гликозил-гидролазы.

 

 

ENZYMES FOR THE DEGRADATION OF RHAMNOGALACTURONAN I AS VIRULENCE FACTORS OF PHYTOPATHOGENIC BACTERIUM Pectobacterium atrosepticum

E.A. Kovtunov1, V.Yu. Gorshkov2, 3, N.E. Gogoleva2, 3, O.E. Petrova2,
E.V. Osipova2, Ch.B. Nuriakhmetova3, S.V. Tatarkin2, Yu.V. Gogolev2, 3

Plant pathogenic pectobacteria (Pectobacterium genus) are well-known all over the world as the causal agents of the cultural plant diseases called soft rots. Rot symptoms are related to the extensive plant tissue maceration due to the production by microorganisms of the plant cell wall degrading enzymes. Most of the pectobacteria-secreted enzymes catalyze the cleavage of homogalacturonan. This polysaccharide, that is a linear homopolymer, consists of galacturonic acid residues and is the most abundant (by mass) pectic polysaccharide of plant cell walls. The knockout of genes of homogalacturonan-degrading enzymes is known to lead to reduced virulence of pectobacteria. In addition, the modification of another pectic compound — rhamnogalacturonan I also occurs in the course of infection process caused by pectobacteria. This compound is a ramified heteropolymer, the backbone of which consists of alternate rhamnose and galacturonic acid residues, and side chains are represented by galactose or arabinose residues. However, the role of pectobacterial enzymes for rhamnogalacturonan I degradation in the development of soft rots has not been previously ascertained. The present study is dedicated to the investigation of the necessity of P. atrosepticum SCRI1043 enzymes degrading rhamnogalacturonan I for a full development of soft rots in the plants infected by pectobacteria. By directed mutagenesis, we have obtained mutant forms of P. atrosepticum SCRI1043 deficient in genes encoding rhamnogalacturonyl hydrolase (genome locus eca3749) that cleaves the backbone of rhamnogalacturonan I, and galactanase (genome locus eca0852) that breaks side chains of this polymer. For the target gene knockout, mutant loci were constructed by overlap-extension PCR. Most of the original gene was replaced by kanamicin-resistance cassette. The obtained construction was ligated into a mobilized suicide vector and the resulting plasmid was transferred into donor E. coli СС118 strain cells. The recombinant plasmid with the mutant locus was introduced into P. atrosepticum SCRI1043 cells by three-parental mating. The P. atrosepticum SCRI1043 clones, in which the original locus was replaced by the mutant one, and the donor plasmid was eliminated, were selected on the selective media. The mutant strains P. atrosepticum SCRI1043∆3749 and P. atrosepticum SCRI1043∆0852 caused significantly less damage to the plant tissues of Brassica rapa spp. pekinensis Cha Cha cv. compared to parental wild-type strain. Herewith, the strain mutant in eca0852 locus encoding galactanase, the enzyme that cleaves side chains of rhamnogalacturonan I, was least virulent. The reduction in virulence, in this case, was not related to the suppression of homogalacturonan-degrading enzyme activity or less motility of bacteria. Thus, we have demonstrated that, first, rhamnogalacturonan I-degrading enzymes may be attributed to virulence factors of phytopathogenic pectobacteria, and second, the hydrolysis of the sides chains of rhamnogalacturonan I contributes more to the process of tissue maceration than the decay of the polymer backbone.

Keywords: Pectobacterium atrosepticum, pectic polysaccharides, rhamnogalacturonan I, glycosyl hydrolases.

 

1ФГАОУ ВО Санкт-Петербургский национальный
исследовательский университет информационных
технологий, механики и оптики,
Лаборатория SCAMT (Solution Chemistry of Advanced
Materials and Technologies),

191002 Россия, г. Санкт-Петербург, ул. Ломоносова, 9,
е-mail: kovtunovea@mail.ru;
2ФГБУН Казанский институт биохимии и биофизики —
подразделение ФИЦ Казанский научный центр РАН,

420111 Россия, Республика Татарстан, г. Казань, 111, а/я 30,
e-mail: gogolev.yuri@gmail.com ✉, gvy84@mail.ru, negogoleva@gmail.com, poe60@mail.ru, eva-0@mail.ru, tatarkins@gmail.com;
3ФГАОУ ВО Казанский (Приволжский) федеральный
университет,

420008 Россия, Республика Татарстан, г. Казань, ул. Кремлевская, 18,
е-mail: ch_nuriakhmetova@mail.ru

Поступила в редакцию
6 ноября 2017 года

 

назад в начало

 


СОДЕРЖАНИЕ

 

 

Полный текст PDF

Полный текст HTML