doi: 10.15389/agrobiology.2019.3.494rus

УДК 632:632.937.15:579.64

Работа поддержана проектом прикладных научных исследований и экспериментальных разработок (ПНИЭР) по лоту шифр 2017-14-579-0030 по теме «Создание микробиологических препаратов для расширения адаптационного потенциала сельскохозяйственных культур по питанию, устойчивости к стрессам и фитопатогенам» (шифр заявки 2017-14-579-0030-013), соглашение № 14.607.21.0178, уникальный идентификатор работ (проекта) RFMEFI60717X0178.

ПОЛИФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА ПРОИЗВОДСТВЕННОГО Bacillus thuringiensis var. thuringiensis 800/15

С.Д. ГРИШЕЧКИНА1, В.П. ЕРМОЛОВА1, Т.К. КОВАЛЕНКО2, К.С. АНТОНЕЦ1, М.Е. БЕЛОУСОВА1, В.В. ЯХНО1,
А.А. НИЖНИКОВ1

Биологические методы регуляции численности вредных организмов — перспективная альтернатива традиционным химическим препаратам. В настоящее время кристаллообразующие бактерии Bacillus thuringiensis рассматриваются в качестве основы производства биологических инсектицидов, поскольку обладают высокой специфичностью в отношении целевых вредителей, безопасны для человека и окружающей среды. Во Всероссийском НИИ сельскохозяйственной микробиологии разработан и получен энтомоцидный биологический препарат широкого спектра действия на основе приоритетного штамма Bacillus thuringiensis var.thuringiensis (BtH1) 800/15. Мы впервые установили, что препарат на основе BtH1 800/15 увеличивает всхожесть семян, высоту проростков и длину корней у различных сельскохозяйственных культур, а также выявили ингибирующую активность препарата в отношении фитопатогенных грибов. Целью нашей работы было изучение полифункциональных свойств препарата на основе штамма Bacillus thuringiensis var. thuringiensis 800/15. Штамм выделили из личинок колорадского жука (Leptinotarsa deсemlineаta Say.) в Ленинградской области, изучили его культурально-морфологические, биохимические, серологические свойства и охарактеризовали согласно классификации H. Dе Barjac и A. Bonnefoi. Секвенирование последовательностей, кодирующих 16S рРНК и B-субъединицу ДНК-гиразы (gyrB), позволило подтвердить, что выделенный штамм 800/15 представляет собой Bacillus thuringiensis var. thuringiensis. Биологический препарат на основе BtH1 800/15 в жидкой форме содержал компоненты культуральной жидкости, споры и энтомоцидные экзо- и эндотоксины. Исходные значения биологической активности препарата были следующими: титр — 3,5×109 КОЕ/мл, содержание экзотоксина для личинок комнатной мухи Musca domestica Linn. в ЛК50 — 3,1 мкл/г корма, энтомоцидная активность для личинок колорадского жука Leptinotarsa decemlineata Say в ЛК50 — 0,28 %. Полевые испытания, проведенные на разных сельскохозяйственных культурах в 2014-2017 годах в Ленинградской области, Краснодарском и Приморском краях, показали весьма высокую (66,7-100 %) эффективность препарата против колорадского жука, картофельной коровки (Henosepilachna vigintioctomaculata Motsch.), капустной моли (Plutella xylostella L.), капустной и репной белянок (Pieris brassica L., P. rapae L.), капустной совки (Barathra brassicae L.), желтого крыжовникового пилильщика (Pteronidea ribesii Scop.), паутинного клеща (Tetranichus urtica L.) и белокрылки (Trialeurodes vaporariorum West.). Лабораторная оценка выявила, что препарат не обладал фитотоксичностью, более того, проявлял ростстимулирующее действие на всхожесть семян (6-21 %), высоту проростков (4-52 %) и длину корней (12-52 %) в зависимости от культуры. Эффективность препарата в отношении фитопатогенных грибов не превышала 54 % и уступала по этим показателям ранее разработанному препарату на основе штамма BtH10 56. Установлена эффективность (100 %) совместного применения препарата BtH1 800/15 и химического инсектицида Децис Экстра, КЭ (концентрат эмульсии) со снижением норм применения соответственно в 2 и 3 раза на картофеле против картофельной коровки. Такая комбинация биологических и химических инсектицидов экономически оправдана и может быть успешно использована в условиях поля при выращивании картофеля.

Ключевые слова: Bacillus thuringiensis, насекомые-фитофаги, фитопатогены, полифункциональные свойства, энтомоцидная, антифунгальная и ростстимулирующая активность.

В последнее время наблюдается снижение темпов роста мирового рынка химических пестицидов с одновременной активацией разработки и производства биологических препаратов. Ожидается, что к 2050 году объемы продаж химических и биологических средств борьбы с вредителями достигнут эквивалентного уровня (1). Биологические препараты служат современной альтернативой традиционным химическим средствам для подавления численности вредных организмов. Они не загрязняют окружающую среду, безопасны для человека, теплокровных животных и полезных организмов, обладают высокой селективностью, эффективны в отношении целевых видов вредителей (2, 3).

Для защиты сельскохозяйственных культур разрабатываются препараты на основе бактерий из рода Bacillus, которые обладают патогенными свойствами в отношении вредных насекомых-фитофагов (4-6), фитопатогенов (7-9), а также фитопатогенных нематод (10). По масштабам производства лидерство принадлежит препаратам, созданным на основе разных подвидов энтомопатогенной бактерииB. thuringiensis Berliner (Bt) (11-13). Для биологического контроля насекомых в агробиоценозах наиболее широко используются препараты на основе трех патовариантов Вt. Патовар А — это подвиды Вt (var. thuringiensis), кристаллы эндотоксинов которых с наибольшей активностью влияют на чешуекрылых (Lepidoptera), патовар В — подвиды Вt (var. israelensis), которые поражают личинок двукрылых (Diptera), патовар С — подвиды Вt (var. tenebrionis, var. darmstadiensis), активные против жесткокрылых (Coleoptera) (4). Выявлен также новый патовар F (от fungi, грибы) с действием на фитопатогенные грибы (14).

Инсектицидные свойства Btсвязаны с продукцией разнообразных токсинов (15-17), среди которых наиболее значимо семейство Cry, относящееся к кристаллическим дельта-эндотоксинам (18, 19). В кишечнике насекомого белковый кристалл превращается в протоксин, переходящий под действием сериновых протеаз в истинный токсин. Последний вызывает патологические процессы, сопровождаемые септицемией — поражением, при котором микроорганизмы колонизируют кровеносную систему насекомого, вызывая его гибель. Важное значение имеет термостабильный водорастворимый β-экзотоксин нуклеотидной природы, продуцируемый бактерией во внешнюю среду, который оказывает метатоксический эффект, включаясь в процессы роста и метаморфоза насекомого-хозяина (4, 20).

Препараты на основе Вt характеризуются полиферментативными свойствами, в них обнаружены различные ферменты из класса гидролаз, благодаря чему, по-видимому, проявляется активность против вредных насекомых и грибов (21, 22). Механизм антифунгального действия Вt связан также с продуцированием других литических ферментов, в частности протеаз и хитиназ, которые разрушают клеточные стенки фитопатогенных грибов (23, 24). В последнее время отмечают, что бактерии рода Bacillus образуют липопептидные антибиотики, отвечающие за антагонистический эффект (25-27).

Один из аспектов полифункциональной активности бактерий рода Bacillus — их способность стимулировать рост растений (28-31). Они колонизируют почвенную ризосферу и ризоплану, продуцируют физиологически активные вещества, могут быть связаны с активизацией генов устойчивости растений (31). Для создания новых препаратов Bt ведется поиск и отбор активных штаммов из природных источников (почва, больные насекомые, зараженные ткани и органы растений), включая селекционные исследования на технологичность, активность и спектр действия (32).

Во Всероссийском НИИ сельскохозяйственной микробиологии (ВНИИСХМ) разработана жидкая форма препарата широкого спектра действия против массовых вредителей-фитофагов на основе штамма B. thuringiensis var. thuringiensis 800/15 (BtH1 800/15) (патент РФ № 2514211 от 27.04.2014) (33), легко разбавляемая водой до необходимой рабочей концентрации и удобная для применения с использованием серийной опрыскивающей аппаратуры.

В представленной работе впервые исследована ростстимулирующая активность препарата на основе BtH1 800/15, а также его антифунгальное действие в отношении фитопатогенных грибов. Установлено, что препарат увеличивает всхожесть семян (от 6 до 21 %), высоту проростков (от 4 до 52 %) и длину корней (от 12 до 52 %) у различных сельскохозяйственных культур. Его ингибирующая активность в отношении фитопатогенов достигает 54 %.

Целью работы было изучение полифункциональных свойств препарата на основе штамма Bacillus thuringiensis var. thuringiensis 800/15.
Методика. Штамм Bacillus thuringiensis var. thuringiensis 800/15 (BtH1 800/15) выделили из мертвых личинок колорадского жука, собранных в Ленинградской области, изучили культурально-морфологические, биохимические, серологические свойства штамма и идентифицировали его согласно классификации H. Dе Barjac и A. Bonnefoi (34-36).

Для определения изолята методами молекулярной филогенетики использовали последовательности генов, кодирующие 16S рРНК и B-субъединицы (gyrB). Штамм 800/15 растили на среде TY в течение 1 сут, после чего 108 клеток бактерий переносили в буфер ТЕ (10 мМ Tris-HCl, 1мМ EDTA, рН 8,0) и инкубировали 10 мин при 95 °С. Полученную ДНК использовали для амплификации последовательностей, кодирующих 16S рРНК (праймеры 27f 5´-GTTTGATCMTGGCTCAG-3´) и 1492R (5´-TAC-GGYTACCTTGTTACGACTT-3’) (37) и gyrB (gyrB_F 5´-CTTGAAGGACT-AGARGCAGT-3´, gyrB_Rf 5´-CCTTCACGAACATCYTCACC-3´) (38) методом ПЦР. Объем реакционной смеси составлял 20 мкл, включая 1 мкл бактериальной ДНК, 0,5 мкл каждого праймера и 10 мкл Fermentas-DreamTaq green PCR master mix («Thermo Fisher Scientific», США). ПЦР проводили с использованием термоциклера T100tm Thermal Cycler («Bio-Rad», США) по следующей программе: 15 мин при 95 °C (начальная денатурация); 30 с при 94 °C (денатурация), 30 с при 55 °C (отжиг), 1 мин при 72 °C (элонгация) (31 цикл); 10 мин при 72 °C (заключительная элонгация). Секвенирование проводили на оборудовании ЦКП «Геномные технологии, протеомика и клеточная биология» (ФГБНУ ВНИИСХМ) по методу Сэнджера (39) Для определения штаммов, наиболее близких по последовательностям 16S рРНК и gyrB,использовали программу BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).

Штамм BtH1 800/15 был депонирован в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения ФГБНУ ВНИИСХМ под регистрационным номером 611 в группе споровых микроорганизмов. Культуру BtH1 800/15 выращивали на плотных питательных средах — мясопептонном агаре (МПА) и на рыбном агаре (РА) при 28-30 °С до полного образования спор и кристаллического эндотоксина. Микроскопию выполняли с использованием черного анилинового красителя на 7-е сут (40). Продуктивность штамма определяли на дрожже-полисахаридных средах при выращивании глубинным способом в колбах Эрленмейера на качалке с аэрацией (220 об/мин) в течение 72 ч при 28 °С.

На основе этого штамма на базе филиала «Экос» ФГБНУ ВНИИСХМ (г. Санкт-Петербург—Колпино) получили партии жидкого биологического препарата. Число клеток, энтомоцидную активность (в ЛК50 для личинок колорадского жука Leptinotarsa decemlineata Say природной популяции) и содержание экзотоксина (в ЛК50 для личинок комнатной мухи Musca domestica Linn.) определяли согласно методике (32).

Антифунгальную активность Bt против различных фитопатогенных грибов определяли методом агаровых блоков в чашках Петри (41). Испытывали препарат на основе штамма BtН1 800/15 в сравнении с препаратом на основе BtН10 56 (эталон). Тест-культурами служили фитопатогенные грибы Botrytis cinerea Pers. (штамм С-5), Pythium spp. (штамм С-2), Bipolaris sorokiniana (Sacc.) Shomaker (штамм С-20), Fusarium avenaceum (Fr.) Sacc. (штамм С-8), F. solani App. et Wr. (штамм С-15), Verticillium dahlia Kleb. (штамм 27). Жидкий препарат Bt (концентрация 5 %) вносили в расплавленную и охлажденную до 40 °С среду Чапека. На поверхность застывшего агара помещали блоки, вырезанные из 10-суточной культуры испытуемых грибов. Контролем служила среда без добавления препарата. Диаметр колоний гриба измеряли через 5 сут. Ингибирующую активность Bt учитывали по формуле W.S. Abbot (42):

где Х — степень ингибирования роста колоний гриба, %; Дк и До — диаметр колонии гриба соответственно в контроле и опыте, см.

Фиторегуляторную активность препарата на основе штамма BtH1 800/15 оценивали в лабораторных опытах по проращиванию семян в рулонах фильтровальной бумаги при 26 °С и влажности 86 %. Семена томата (Solanum lycopersicum), огурца (Cucumis sativum), кабачка (Cucurbita pepo var. giromontina), свеклы (Beta vulgaris), тыквы (Cucurbita pepo), капусты (Brassica oleraceae) замачивали на 3 ч в культуральной жидкости (КЖ) штамма BtH1800/15 и в питательной среде (контроль). Через 5 сут учитывали всхожесть семян, через 3 нед измеряли высоту проростков и длину корней (43).

Полевые испытания эффективности жидкого препарата против массовых вредителей проводили в хозяйствах Ленинградской области, Краснодарского и Приморского края в 2014-2017 годах. Вегетирующие растения картофеля (Solanum tuberosum) обрабатывали суспензией жидкого препарата в период отрождения личинок колорадского жука L1-2. В Краснодарском крае испытания проводили в полевых условиях на сое (Glycine max) против паутинного клеща (Tetranichus urtica L.) и в защищенном грунте на огурцах против паутинного клеща и белокрылки (Trialeurodes vaporariorum West.). Норма применения препарата — 15-20 л/га, расход рабочей жидкости — 200-400 л/га.

В Ленинградской области препарат испытывали на белокочанной капусте (Brassica oleraceae) против капустной моли (Plutella xylostellaL.), капустной и репной белянок (Pieris brassica L., P. rapae L.), капустной совки (Barathra brassicae L.) (10-15 л/га), на крыжовнике (Ribes vivacrispa) против желтого крыжовникового пилильщика (Pteronidea ribesii Scop.) (20 л/га). В Приморском крае против картофельной коровки (henosepilachna vigintioctomaculata Motsch.) на картофеле испытали биопрепарат и химический инсектицид Децис Экстра, КЭ (концентрат эмульсии) (Decis®, «Bayer AG», Германия) в рекомендуемых дозах применения — соответственно 15 и 0,03 л/га, а также при их совместном использовании в баковых смесях со снижением норм в 2 и 3 раза (7,5 л/га и 0,01 л/га).

Полученные данные обрабатывали методом дисперсионного анализа при доверительном интервале 95 % (44). Рассчитывали средние (М) и стандартные ошибки средних (±SEM). Статистическую значимость различий оценивали по t-критерию Стьюдента при доверительном интервале 95 % (р < 0,05).

Результаты. На основании классического подхода (34-36) штамм 800/15 ранее был охарактеризован как B. thuringiensis var. thuringiensis. Мы подтвердили его таксономическую принадлежность методами молекулярной систематики. С помощью программы BLAST были найдены штаммы, последовательность 16S рРНК которых оказалась наиболее близка к 800/15 — Bacillus cereus VLS-S-1, Bacillus thuringiensis HC2, Bacillus toyonensis PgBe301. Следовательно, локус 16S рРНК был слишком консервативным для точной идентификации таксономического положения исследуемого штамма, однако позволил подтвердить его принадлежность к роду Bacillus.

Для уточнения филогенетического положения штамма 800/15 мы секвенировали ген gyrB, кодирующий B-субъединицу ДНК-гиразы. Этот локус менее консервативный, чем последовательность 16S рДНК, что позволяет различать филогенетически близкие группы. Последовательность gyrB штамма 800/15 была наиболее близка к последовательности штамма Bacillus thuringiensis ATCC 10792 и Bacillus thuringiensis Bt407, ранее отнесенного к серотипу BtH1 (37). То есть методом молекулярной систематики было подтверждено, что штамм 800/15 представляет собой B. thuringiensis var. thuringiensis.

Далее мы выяснили, обладает ли препарат на основе BtH1 800/15 полифункциональными свойствами. На первом этапе образцы проверяли на активность. Титр составлял 3,5-3,6±0,2 млрд КОЕ/мл, содержание экзотоксина для личинок Muscadomestica в ЛК50 — 3,1-3,2±0,1 мкл/г корма, энтомоцидная активность для личинок Leptinotarsa decemlineata в ЛК50— 0,26-0,28±0,02 %.

В полевых испытаниях биологическая эффективность полученного препарата достигала 70-100 % гибели насекомых (табл. 1). При применении препарата отмечали прибавку урожайности относительно контроля у картофеля (Ленинградская обл., Краснодарский край) и капусты (Ленинградская обл.) (данные не приведены).

Исследования в лабораторных условиях показали, что препарат не обладал фитотоксичностью для растений, более того, проявлял ростстимулирующее действие, включая увеличение всхожести семян свеклы и капусты на 6 %, огурцов — на 10 %, кабачков — на 21 %, томатов — на 11 %, тыквы — на 21 %; высоты проростков свеклы на 4 %, огурцов — на 8 %, кабачков — на 52 %, капусты — на 36 %, тыквы — на 38 %; длины корней свеклы на 12 %, огурцов — на 19 %, кабачков — на 52 %, томатов — на 28 %, капусты — на 48 %, тыквы — на 42 % (табл. 2). Исследуемые культуры по-разному реагировали на действие BtH1 800/15. На кабачках, томатах, капусте, тыкве стимуляция оказалась значительно выше в сравнении со свеклой и огурцами. Высота проростков при обработке семян томатов, капусты, тыквы, кабачков находилась в пределах от 6,4±0,7 до 14±0,75 см против показателей в контроле от 4,2±0,65 до 9,9±0,25 см (что, как уже отмечалось, на 36-52 % выше), длина корней в случае обработанных семян капусты, тыквы и кабачков составила 7,4±0,55; 15,9±0,75 и 22,5±0,9 см значениях в контроле соответственно 5,0±0,25; 11,2±0,45 и 14,8±0,75 см (различия с контролем статистически значимы при р < 0,05). Препарат также достоверно стимулировал рост корней тыквы, капусты, кабачков (на 42-52 %).

Было установлено, что препарат на основе штамма BtH1 800/15 обладает антифунгальной активностью, однако она ниже, чем у препарата на основе штамма BtH10 56 (табл. 3). В среднем в отношении грибов Botrytis cinerea Pers, Pythium spp., Bipolaris sorokiniana и Verticillum dahlia для BtH1 800/15 ингибирование составило соответственно 51,15±1,75; 40,35±1,65; 21,55±1,45 и 18,45±0,45 %. Для дальнейшего отбора продуцента BtH1 800/15 на антифунгальную активность необходимо уточнять селекционные критерии, что запланировано на следующем этапе исследований.

В Приморском крае мы сравнили действие препарата на основе штамма BtH1 800/15 и химического инсектицида Децис Экстра, КЭ на картофеле против картофельной коровки. Испытания показали, что биологическая эффективность при совместном применении препаратов в пониженных дозах не уступала таковой для химического эталона и составляла 100 % гибели картофельной коровки на 10-е сут после обработки растений. Следовательно, совместное использование указанных препаратов вполне уместно и экономически оправдано на картофельных полях при их заселенности вредителем с преобладанием личинок старших возрастов и имаго.

В лабораторных опытах было установлено, что химический препарат Децис Экстра, КЭ не оказывал отрицательного влияния на жизнеспособность BtH1 как в сублетальных дозах, так и в повышенных рекомендуемых концентрациях при совместном применении.

Совместное использование биопрепаратов с химическими средствами защиты растений приводит к снижению стрессового воздействия на растения и повышению экономической эффективности препаратов за счет снижения норм расхода. Синергетический эффект применения биологических препаратов на основе B. thuringiensis совместно с химическими инсектицидами отмечен в специальной литературе. Так, использование бактокулицида (на основе B. thuringiensis var. israelensis) в сочетании с ингибитором синтеза хитина димилином в сниженных (в 4-8 раз) дозах вызывало гибель личинок шампиньонного комарика Lycoriella solani Winn. до 91,2 % и прибавку урожая до 58,6 % (45). Е.А. Иванцова, оценивая действие бацикола (на основе B. thuringiensis var. darmstadiensis) против вредителей горчицы совместно с инсектицидом Фастак (Fastac®, «BASF SE», Германия) в малотоксических дозах, отмечала их взаимно усиливающий эффект (46). Показана высокая эффективность бактокулицида против рисового комарика Cricotopus silvestris Fabr. в сочетании с гербицидами Пропонит (Proponit®, «Arysta LifeScience S.A.S.», Франция), Базагран (Basagran®, «BASF SE», Германия), 2М-4Х (MCPA, «Bayer AG», Германия), Ордрам (Ordram®, «Syngenta AG», Швейцария). Отрицательного действия гербицидов на жизнеспособность бактерии B. thuringiensis var. israelensis не выявлено (47).

Таким образом, препарат, полученный на основе штамма B. thuringiensis var. thuringiensis 800/15, обладает энтомоцидной активностью, ростстимулирующим и антифунгальным свойствами. Он перспективен для использования против опасных массовых вредителей на широком круге сельскохозяйственных растений (картофеле, крестоцветных культурах и ягодниках). Представляется экономически и экологически оправданным совместное применение препарата с химическим инсектицидом при заселенности картофельных полей личинками старших возрастов и имаго Leptinotarsa decemlineata Say. и henosepilachna vigintioctomaculata Motsch.

 

1. Эффективность жидкого препарата на основе штамма Bacillus thuringiensis var. thuringiensis 800/15 против вредителей-фитофагов в различных географических зонах (2014-2017 годы)

Вид насекомого-вредителя

Географическая зона

Культура

Биологическая
эффективность, %

Колорадский жук (Leptinotarsa decemlineata Say.)

Краснодарский край, Ленинградская область

Картофель

95,9-98,8

Картофельная коровка (henosepilachnavigintioctomaculataMotsch.)

Приморский край

Картофель

66,7-70,0

Паутинный клещ (Tetranichus urticae Koch.)

Краснодарский край

Огурцы

97,6-98,4

Соя

95,8-96,2

Белокрылка (Trialeurodes vaporariorum West.)

Краснодарский край

Огурцы

99,8-100,0

Капустная моль (Plutella maculipennis Curt.)

Ленинградская область

Капуста

80,0-90,1

Капустная белянка (Pieris brassicae L.)

Ленинградская область

Капуста

94,7-95,6

Репная белянка (Pieris rapae L.)

Ленинградская область

Капуста

84,5-96,7

Капустная совка (Barathra brassicae L.)

Ленинградская область

Капуста

90,0-92,8

Желтый крыжовниковый пилильщик (Pteronidear ribesii Scop.)

Ленинградская область

Крыжовник

70,8-72,4

Примечание. Диапазон значений эффективности препарата представлен на основе усредненных данных.

 

2. Фиторегуляторная активность препарата на основе штамма Bacillus thuringiensis var. thuringiensis 800/15 в отношении различных сельскохозяйственных культур

Культура

Всхожесть семян, %

Высота проростков, см

Длина корней, см

контроль

после обработки

контроль

после обработки

контроль

после обработки

всего

к контролю, %

всего

к контролю, %

всего

к контролю, %

Свекла

92-96

99

106

4,2-5,0

4,8-5,1

104

3,5-4,0

3,8-4,7

112

Огурцы

87-90

99

110

4,6-5,3

5,2-5,7

108

4,9-5,2

4,9-5,2

119

Кабачки

77-80

91-96

120

9,7-10,2

11,4-15,7

142

14,0-15,9

14,0-15,9

152

Томаты

88-91

99

111

4,3-4.8

5,6-7,0

152

12,9-14,0

12,9-14,0

128

Капуста

92-94

99

106

4,9-5,9

7,1-7,9

136

4,8-5,3

4,8-5,3

148

Тыква

77-80

91-98

120

7,4-8,3

10,4-11,3

138

10,7-11,8

10,7-11,8

142

 

3. Антифунгальная активность препаратов на основе штаммов Bacillus thuringiensis var. thuringiensis (BtH1) и Bacillus thuringiensis var. darmstadiensis (BtH10)

Вид фитопатогенного гриба

Ингибирование роста колоний гриба через 5 сут, %

BtH1 800/15

BtH10 56

Botrytis cinerea Pers (штамм С-5)

48,3-54,0

100

Pythium spp. (штамм С-2)

38,7-42,0

83,2-86,5

Bipolaris sorokiniana (Sacc)Shoemaker (штамм С-20)

20,1-23,0

74,1-75,3

Fusarium avenacrum (Fr.) (Sacc) (штамм С-8)

0

50,0-51,2

Fusarium solani App. et Wr. (штамм С-3)

0

25,2-26,0

Verticillum dahlia Kleb. (штамм 27)

18,0-18,9

50,7-52,0

Примечание. Ингибирующую активность препарата рассчитывали по формуле W.S. Abbot (см. раздел «Методика»).

 

 

ЛИТЕРАТУРА

  1. Olson S. An analysis of the biopesticide market now and where it is going. Outlooks on Pest Management, 2015, 26(5): 203-206 (doi: 10.1564/v26_oct_04).
  2. Siegel J.P. The Mammalian Safety of Bacillus thuringiensis- Based Insecticides. Journal of Invertebrate Pathology, 2001, 77(1): 13-21 (doi: 10.1006/jipa.2000.5000).
  3. Raymond B., Federici B.A. In deference of Bacillus thuringiensis, the safest and most success the microbial insecticide available to humanity — a response to EFSA. FEMS Microbiology Ecology, 2017, 93(7): fix084 (doi: 10.1093/femsec/fix084).
  4. Кандыбин Н.В., Патыка Т.И, Ермолова В.П., Патыка И.Ф. Микробиоконтроль численности насекомых и его доминанта Bacillusthuringiensis. СПб—Пушкин, 2009.
  5. Polanczyk R.A., Pires da Silva R.F., Fiuza L.M. Effectiveness of Bacillus thuringiensis against Spodoptera frugipera (Lepidoptera: Noctuidae). Brazilian Journal of Microbiology, 2000, 31(3): 165-167 (doi: 10.1590/S1517-83822000000300003).
  6. Eswarapriya B., Gopalsamy B., Kameswari B., Meera R., Devi P. Insecticidal activity of Bacillus thuringiensis IBt-15 strain against Plutella xylostella. International Journal of PharmTech Research, 2010, 2(3): 2048-2053.
  7. Seo D.J. Nguyen D.M.С., Song Y.S., Jung W.J. Induction of defense response against Rhizoctonia solani in cucumber plants by endophytic bacterium Bacillus thuringiensis GS1. J. Microbiol. Biotechnol., 2012, 22(3): 407-415 (doi: 10.4014/jmb.1107.07027).
  8. Martinez-Absalón S., Rojas-Solís D., Hernández-León R., Prieto-Barajas C., Orozco- Mosqueda M., Peña-Cabriales J.J., Sakuda S., Valencia-Cantero E., Santoyo G. Potential use and mode of action of the new strain Bacillus thuringiensis UM96 for the biological control of the grey mould phytopathogen Botrytis cinerea. Biocontrol Science and Technology, 2014, 24(12): 1349-1362 (doi: 10.1080/09583157.2014.940846).
  9. Heydari A., Pessaraki M. A review on biological control of fungal plant pathogens using microbial antagonists. Journal of Biological Sciences, 2010, 1(4): 273-290 (doi: 10.3923/jbs.2010.273.290).
  10. Mohammed S.H., El Saedy M.A., Enan M.R., Nasser E.I., Ghareeb A., Salah A.M. Biocontrol efficiency of Bacillus thuringiensis toxins against root-knot nematode, Meloidogyne incognita. J. Cell Mol. Biol., 2008, 7(1): 57-66.
  11. Pane C., Villecco D., Campanile F., Zaccardelli M. Novel strains of Bacillus isolated from compost and compost-amended soils as biological control agents against soil-borne phytopathogenic fungi. Biocontrol Science and Technology, 2012, 22(12): 1373-1388 (doi: 10.1080/09583157.2012.729143).
  12. Akram W., Mahboob A., Jave A.A. Bacillus thuringiensis strain 199 can induce systemic resistance in tomato against Fusarium wilt. European Journal of Microbiology and Immunology, 2013, 3(4): 275-280 (doi: 10.1556/EuJMI.3.2013.4.7).
  13. Tao A., Pang F., Huang S., Yu G., Li B., Wang T. Characterization of endophytic Bacillus thuringiensis strains isolated from wheat plants as biocontrol agents against wheat flag smut. Biocontrol Science and Technology, 2014, 24(8): 901-924 (doi: 10.1080/09583157.2014.904502).
  14. Смирнов О.В. Патотипы Bacillus thuringiensis и экологические основы их использования в защите растений. Автореф. докт. дисс. СПб—Пушкин, 2000.
  15. Shrestha A., Sultana R., Chae J.-C., Kim K., Lee K.-J. Bacillus thuringiensis C25 which is rich in cеll wall degrading enzymes efficiently controls lettuce drop caused by Sclerotinia minor. Eur. J. Plant Pathol., 2015, 142(3): 577-589 (doi: 10.1007/s10658-015-0636-5).
  16. Loseva O., Ibrahim M., Candas M., Koller C.N., Bauer L.S., Bulla Jr L.A. Changes in protease activity and Cry3Aa toxin binding in the Сolorado potato beetle: implications for insect resistance to Bacillus thuringiensis toxins. Insect Biochemistry and Molecular Biology, 2002, 32(5): 567-577 (doi: 10.1016/S0965-1748(01)00137-0).
  17. Zhong C.H., Ellar D.J., Bishop A., Johnson C., Lin S.S., Hart E.R. Characterization of Bacillus thuringiensis δ-endotoxin which is toxic to insects in three orders. Journal of Invertebrate Pathology, 2000, 76(2): 131-139 (doi: 10.1006/jipa.2000.4962).
  18. Aronson A.I., Shai Y. Why Bacillus thuringiensis insecticidal toxins are so effective: unique features of their mode of action. FEMS Microbiology Letters, 2001, 195(1): 1-8 (doi: 10.1111/j.1574-6968.2001.tb10489.x).
  19. Knaak N., Rohr A., Fiuza L. In vitro effect of Bacillus thuringiensis strains and Cry proteins in phytopathogenic fungi of paddy rice-field. Brazil. J. Microbiol., 2007, 38(3): 526-530 (doi: 10.1590/S1517-83822007000300027).
  20. Штерншис М.В., Беляев А.А., Цветкова В.П. Шпатова Т.В., Леляк А.А., Бахвалов С.А. Биопрепараты на основе бактерий рода Bacillus для управления здоровьем растений. Новосибирск, 2016.
  21. Wagner W., Möhrlen F., Schnetter W. Characterization of the proteolytic enzymes in the midgut of the European Cockchafer, Melolontha melolontha (Coleoptera: Scarabaidae). Insect Biochemistry and Molecular Biology, 2002, 32(7): 803-814 (doi: 10.1016/S0965-1748(01)00167-9).
  22. Смирнов О.В., Гришечкина С.Д. Полифункциональная активность Bacillus thuringiensis Berliner. Сельскохозяйственная биология, 2011, 3: 123-126.
  23. Reyes‐Ramírez A., Escudero-Abarca B.I., Aguilar-Uscanga G., Hayward-Jones P.M., Barboza-Corona J.E. Antifungal activity of Bacillus thuringiensis chitinase and its potential for the biocontrol of phytopathogenic fungi in soybean seeds. Journal of Food Science, 2004, 69(5): M131-M134 (doi: 10.1111/j.1365-2621.2004.tb10721.x).
  24. Xiao L., Xie C.-C., Cai J., Lin Z.-J., Chen Y.-H. Identification and characterization of chitinase producing Bacillus slowing significant antifungal activity. Curr. Microbiol., 2009, 58(5): 528-533 (doi: 10.1007/s00284-009-9363-5).
  25. Kim P.I., Bai H., Bai D., Chae H., Chung S., Kim Y., Park R., Chi Y.-T. Purification and characterization of a lipopeptide produced by Bacillus thuringiensis CMB26. Journal of Applied Microbiology, 2004, 97(5): 942-949 (doi: 10.1111/j.1365-2672.2004.02356.x).
  26. Yánez-Mendizábal V., Zeriouh H., Viñas I., Torres R., Usall J., de Vicente A., Pérez-García A., Teixidó N. Biological control of peach brown rot (Monilinia spp.) by Bacillus subtilis CPA-8 is based on production of fengycin-like lipopeptides. Eur. J. Plant Pathol., 2011, 132(4): 609-619 (doi: 10.1007/s10658-011-9905-0).
  27. Elkahoui S., Djébalin N., Karkouch I., Hadj Ibrahim A., Kalai L., Bachkouel S., Tabbene O., Limam F. Mass spectrometry identification of antifungal lipopeptides from Bacillus sp. BCLRB2 against Rhizoctonia solani and Sclerotinia sclerotiorum. Appl. Biochem. Microbiol., 2014, 50(2): 161-165 (doi: 10.1134/S0003683814020082).
  28. Choudhary D.K., Johri B.N. Interactions of Bacillus spp. and plants — With special reference to induced systemic resistance (ISP). Microbiological Research, 2009, 164(5): 493-513 (doi: 10.1016/j.micres.2008.08.007).
  29. Kumar P., Dubey R.C., Maheshwari D.K. Bacillus strain isolated from rhizosphere showed plant growth promoting and antagonistic activity against phytopathogens. Microbiological Research, 2012, 167(8): 493-499 (doi: 10.1016/j.micres.2012.05.002).
  30. Чеботарь В.К., Наумкина Т.С., Борисов А.Ю. Комплексное микробное удобрение «Бисолбимикс» /Под ред. А.Ю. Борисова. СПб, 2015.
  31. Partida-Мartínez L.P., Heil M. The microbe-free plant root: fact or artifact? Frontiers in Plant Science, 2011, 2(100): 1-16 (doi: 10.3389/fpls.2011.00100).
  32. Гришечкина С.Д., Ермолова В.П., Минина Г.Н., Сафронова В.И., Бологова Е.В. Методика. Коллекция штаммов бактерий-симбионтов вредных насекомых и грызунов, пригодных для биоконтроля численности вредителей сельскохозяйственных растений. СПб, 2014.
  33. Тихонович И.А., Ермолова В.П., Гришечкина С.Д., Романова Т.А. Штамм бактерий Bacillus thuringiensis var. thuringiensis №800/15 в качестве средства для получения энтомоцидного биопрепарата. Патент RU 2514211 С1. Заявл. 10.10.2012. Опубл. 27.04.2014. Бюл. № 12.
  34. De Barjac H., Bonnefoi A. Essai de classification biochmique et seroloque de 24 coucher de Bacillus du type B. thuringiensis. Entomophaga, 1962, 7(1): 5-31 (doi: 10.1007/BF02375988).
  35. De Barjac H., Bonnefoi A. A classification strains of Bacillus thuringiensis Berliner with a key to their differentiation. Journal of Invertebrate Pathology, 1968, 11(3): 335-347 (doi: 10.1016/0022-2011(68)90182-1).
  36. De Barjac H., Bonnefoi A. Misse au point sur la classification des Bacillus thuringiensis. Entomophaga, 1973, 18(1): 5-17 (doi: 10.1007/BF02373009).
  37. Lane D.J. 16S/23S rRNA sequencing. In: Nucleic acid technics in bacterial systematics /E. Stackebrandt, M. Goodfellow (eds.). John Wiley & Sons, Chichester, NY, 1991: 115-175.
  38. Punina N.V., Zotov V.S., Parkhomenko A.L., Parkhomenko T.U., Topunov A.F. Genetic diversity of Bacillus thuringiensis from different geo-ecological regions of Ukraine by analyzing the 16S rRNA and gyrB genes and by AP-PCR and saAFLP. Acta Naturae, 2013, 5(1): 90-100.
  39. Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1977, 74(12): 5463-5467 (doi: 10.1073/pnas.74.12.5463).
  40. Кольчевский А.Г., Рыбина Л.М., Коломиец В.Я. Выделениеиотборвысоковирулентныхкультур Bacillus thuringiensis var. galleriae. Методическиерекомендации/Под ред. В.А. Павлюшина. Л., 1987.
  41. Методы экспериментальной микологии /Под ред. В.И. Билай. Киев, 1982.
  42. Abbot W.S. A method for computing the effectiveness of insecticide. Journal of Economic Entomology, 1925, 18(2): 265-267 (doi: 10.1093/jee/18.2.265a).
  43. Бенкен А.А., Хацкевич Л.К., Гришечкина С.Д. Ускоренный метод оценки болезнеустойчивости сортообразцов ячменя и паразитических свойств возбудителя фузариозной корневой гнили. Информационный листок. СПб, 1983.
  44. Доспехов Б.А. Методика полевого опыта. М., 1985.
  45. Мокроусова Е.П., Глазунова И.Н., Кандыбин Н.В., Ермолова В.П. Совместное применение ингибиторов синтеза хитина с микробиологическими препаратами против вредителей шампиньонов. Проблемы энтомологии в России. СПб, 1998, т. 2: 40-41.
  46. Иванцова Е.А. Оптимизация фитосанитарного состояния агробиоценозов Нижнего Поволжья. Автореф. докт. дис. Саратов, 2009.
  47. Стусь А.А., Ермолова В.П. Кандыбин Н.В. Действие бактокулицида в смеси с гербицидами на личинок рисового комарика (Cricotopyssilvestris Fabr). Бюлл. ВНИИСХМ, 1989, 52: 25-27.

 

 

POLYFUNCTIONAL PROPERTIES OF THE Bacillus thuringiensis var. thuringiensis INDUSTRIAL STRAIN 800/15

S.D. Grishechkina1, V.P. Ermolova1, T.K. Kovalenko2, K.S. Antonets1, M.Е. Belousova1, V.V. Yaкhno1, A.A. Nizhnikov1

ORCID:

Grishechkina S.D. orcid.org/0000-0002-4877-705X
Belousova M.V. orcid.org/0000-0002-2886-026X
Ermolova V.P. orcid.org/0000-0002-9473-8334
Yaкhno V.V. orcid.org/0000-0001-7953-3405
Kovalenko T.K. orcid.org/0000-0003-1432-4500
Nizhnikov A.A. orcid.org/0000-0002-8338-3494
Antonets K.S. orcid.org/0000-0002-8575-2601

Crop losses caused by pests can reach 40-50 % and even more. Application of biological methods for regulation of the harmful species is promising and providing ecological safety. Biological preparations based on the living cultures of microorganisms and their metabolites meet these requirements. Currently, the crystal-forming bacterium Bacillus thuringiensis is considered to be the most important species for production of biological insecticides, since this bacterium exhibits high specificity in relation to the target pathogens, safety for humans and the environment. At ARRIAM, the biological preparation based on the Bacillus thuringiensis var. thuringiensis (BtH1) 800/15 strain was developed. The strain was isolated from larvae of the Colorado potato beetle (Leptinotarsa deсemlineаta Say.) in the Leningrad region, studied for culture-morphological, biochemical and serological properties and identified according to the classification of De Barjac and Bonnefoi. Sequencing of the genes encoding 16S RNA and B-subunit of the DNA-gyrase (GyrB) confirmed that the isolated strain 800/15 belongs to Bacillus thuringiensis var. thuringiensis. The BtH1 800/15 strain was deposited in the Russian Collection of Agricultural Microorganisms (RCAM) under the registration number 611 (Patent of the Russian Federation RU 2514211 C1 of 27.04.2014). This paper is the first to report that the BtH1 800/15-based biologicals increases the germination of seeds, the height of seedlings and the root length of various crops, and also revealed the inhibitory activity against phytopathogenic fungi. The goal of this study was to investigate whether the biological preparation based on the BtH1 800/15 strain has multifunctional properties including entomocidal activity against mass insect pests of crops, growth-stimulating effect on economically significant plant species and antifungal activity against phytopathogenic fungi. The preparation based on the BtH1 800/15 strain is a liquid that is easily diluted with water to the required concentration and contains the components of the cultural medium, spores and entomocidal exo- and endotoxins. The initial values of the biological activity of the preparation were as follows: titer was 3.5×109 CFU/ml, exotoxin content for the Musca domestica Linn. larvae in LC50 was 3.1 μl/g of feed, entomocidal activity for the larvae of the Colorado beetle Leptinotarsa decemlineata Say. in LC50 was 0,28 %. The paper presents the data of field trials of the effectiveness of the preparation carried out on different agricultural crops in the period of 2014-2017 in the Leningrad Region, Krasnodar and Primorsky Krai against phytophagous insects, the Colorado beetle (L. decemlineata Say.), the 28-spotted potato ladybird (Henosepilachna vigintioctomaculata Motsch.), the diamondback moth (Plutella xylostella L.), the cabbage white and the small white (Pieris brassica L., P. rapae L.), cabbage moth (Barathra brassicae L.), gooseberry sawfly (Pteronidea ribesii Scop.), red spider mite (Tetranichus urtica Koch.) and whitefly (Trialeurodes vaporariorum West.). Field tests demonstrated the effectiveness of this biological preparation against harmful phytophagous insects (66.7-100 %). The laboratory tests revealed that the preparation did not exhibit phytotoxicity, moreover, it showed a growth-stimulating effect on the seed germination (up to 32 %), as well as the height of seedlings and root length (up to 52 %). The efficacy of the preparation against phytopathogenous fungi did not exceed 54 % and was inferior to the preparation based on the BtH10 strain 56. The combined use of the biological preparation based on the BtH1 800/15 strain with the chemical insecticide Decis Extra, CE (emulsion concentrate) on potato against H. vigintioctomaculata Motsch. was very efficient (100 %) even if the application rates were reduced 2 and 3 times, respectively. This combination of biological and chemical insecticides is economically valuable and can be successfully used in potato fields when they are pest-infected, with the predominance of larvae of older ages and imago, which allows a significant reduction of the pesticide load. Overall, data obtained show that the biological preparation based on the Bacillus thuringiensis var. thuringiensis strain 800/15 has multifunctional properties, including entomocidal, antifungal and growth-stimulating activities, and is also promising for joint use with chemical insecticides.

Keywords: Bacillus thuringiensis, phytophagous insects, phytopathogens, polyfunctional properties, entomocidal, antifungal and growth-stimulating activity.