doi: 10.15389/agrobiology.2018.3.521rus

УДК 635.655:581.143.6:58.085

Работа выполнена при частичной финансовой поддержке гранта Президента Российской Федерации для государственной поддержки молодых российских ученых в рамках проекта МК-9241.2016.11 и в рамках государственного задания ФАНО России № АААА-А17-117091460013-5.

 

ИНДУКЦИЯ НЕПРЯМОГО ОРГАНОГЕНЕЗА ПОБЕГОВ СОИ
Glycine max (L.) Merr. ИЗ СЕГМЕНТОВ СТЕБЛЯ ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ
В КАЧЕСТВЕ ЭКСПЛАНТОВ ПРИ АГРОБАКТЕРИАЛЬНОЙ
ТРАНСФОРМАЦИИ

Н.В. ВАРЛАМОВА1, М.А. РОДИОНОВА1, Л.Н. ЕФРЕМОВА1,
П.Н. ХАРЧЕНКО1, Д.А. ВЫСОЦКИЙ1, М.Р. ХАЛИЛУЕВ1,2

Соя Glycine max (L.) Merr. — важнейшая продовольственная, техническая и кормовая культура. В настоящее время широкое распространение в мире получает выращивание генно-модифицированных растений сои с повышенной устойчивостью к гербицидам и вредителям, а также пониженным содержанием линоленовой кислоты по сравнению с сортами и гибридами традиционной селекции. Более 85 % трансгенных растений сои было получено методом агробактериальной трансформации. К настоящему времени разработаны протоколы агробактериальной трансформации сои посредством соматического эмбриогенеза, а также прямого или непрямого органогенеза. При этом в качестве эксплантов используют семядоли, семядольные узлы, сегменты гипокотиля и эпикотиля, незрелые и зрелые зародыши. Однако, несмотря на большое число известных протоколов, генетическая трансформация сои не стала еще рутинной процедурой, поскольку существенным образом зависит от особенностей конкретного генотипа. В доступной литературе данные об использовании сегментов стебля для генетической трансформации сои практически отсутствуют, хотя этот тип экспланта широко и эффективно применяют при получении большинства трансгенных растений из класса Dicotyledoneae. Мы впервые на модели двух перспективных селекционных форм сои (линии 1476 и 1477) получили экспериментальные данные, подтверждающие способность сегментов стебля к органогенезу побегов в культуре in vitro, а также их использование в качестве эксплантов для генетической трансформации посредством Agrobacterium tumefaciens. Индукцию каллусо- и органогенеза осуществляли с использованием 4 вариантов питательных сред, составленных по прописи Мурасиге-Скуга (MS) и дополненных 6-бензил-аминопурином (6-БАП) в разных концентрациях (0,5 и 1 мг/л) в сочетании с 0,1 мг/л 3-ин-долилуксусной кислоты (ИУК) или 0,1 мг/л ИУК и 0,5 мг/л 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-Д). Было показано, что изученные генотипы сои существенно различаются по способности к морфогенезу in vitro. Экспериментально подтверждено, что добавление ауксина 2,4-Д приводило к ингибированию органогенеза побегов у обоих генотипов. Установлены типы и концентрации регуляторов роста (1 мг/л 6-БАП в сочетании с 0,1 мг/л ИУК), обеспечивающие максимальный выход регенерантов. Для линии 1476 разработан эффективный протокол непрямого органогенеза побегов из сегментов стебля с частотой более 50 %, который использовали в последующих экспериментах по генетической трансформации штаммом A. tumefaciens AGL0, содержащим плазмиду pCambia1381Z-pro-SmAMP1-771. В результате поэтапной селекции на питательной среде для индукции морфогенеза с добавлением гигромицина В (1-10 мг/л) отобрали 8 независимых линий первичных трансформантов. У 4 из них присутствие селективного (hpt) и маркерного (uidA) генов подтверждено методом ПЦР. После проведения ПЦР-анализа была рассчитана эффективность трансформации, которая составила 2,0 %. Полученные результаты свидетельствуют об успешном применении и перспективности использования сегментов стебля в качестве эксплантов для генетической трансформации сои.

Ключевые слова: Glycine max (L.) Merr., соя, культура in vitro, органогенез побегов, агробактериальная трансформация.

 

Полный текст

 

NDIRECT SHOOT ORGANOGENESIS OF SOYBEAN Glycine max (L.) Merr.
FROM STEM SEGMENTS AND USE OF THE EXPLANTS FOR Agrobacterium-MEDIATED TRANSFORMATION

N.V. Varlamova1, M.A. Rodionova1, L.N. Efremova1, P.N. Kharchenko1, D.A. Vysotskii1, M.R. Khaliluev1,2

Soybean Glycine max (L.) Merr. is an important oil, food and fodder crop for human and animals fodder. Currently, soybean lines genetically modified for improved resistance to herbicides and pests and for reduced linolenic acid content are widely grown. More than 85 % of transgenic soybean plants are obtained using Agrobacterium-mediated transformation method. Developed Agrobacterium-mediated protocols are based on somatic embryogenesis and direct or indirect shoot organogenesis. Cotyledons, cotyledonary nodes, hypocotyl and epicotyl segments, immature or mature embryos serve as explants. Despite the large number of Agrobacterium-mediated protocols, stable transformation of soybeans is still not a routine procedure because it depends on the genotype. Surprisingly, the data on the use of soybean stem segments in genetic transformation is practically absent, although stem segments widely and efficiently serve as explants in the production of most transgenic monocotyledonous plants. Thus, the purpose of the study was to develop a protocol for shoot organogenesis from stem segments of soybean and their application as explants for the production of transgenic plants by Agrobacterium-mediated transformation. Stem segments of aseptic soybean seedlings of breeding lines 1476 and 1477 were used for callus induction and shoot organogenesis. The explants were cultured on four various MS-based growing media which differed in 6-benzylaminopurine (BA) concentrations (0.5 and 1.0 mg/l) in combination with i) 0.1 mg/l indole-3-acetic acid (IAA), or ii) 0.1 mg/l indole-3-acetic acid (IAA) and 0.5 mg/l 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2.4-D). It was shown that the studied soybeans genotypes differ significantly in morphogenetic ability. Out experiments confirmed that the addition of 2.4-D resulted in inhibition of shoot organogenesis in the both genotypes. It was found that 1 mg/l BA in combination with 0.1 mg/l IAA are the best growth regulators providing the highest frequency of indirect shoot organogenesis. As a result, an effective protocol of indirect shoot organogenesis from soybean stem segments of line 1476 seedlings was developed which ensures more than 50 % frequency of organogenesis. This protocol was applied in genetic transformation of soybean line 1476 by Agrobacterium tumefaciens strain AGL0 carrying the plasmid pCambia1381Z-pro-SmAMP1-771. By gradual selection on the induction medium supplemented with hygromycin B (1-10 mg/l), 8 independent lines of putative primary transformants were selected. PCR analysis confirmed the presence of the selective (hpt) and marker (uidA) genes in 4 independent transgenic lines. The transformation efficiencies calculated based on the results of PCR analysis was 2.0 %. These results indicate the successful involvement of stem segments as explants for genetic transformation of soybean.

Keywords: soybean, Glycine max (L.) Merr., in vitroculture, shoot organogenesis, Agrobacterium-mediated transformation.

 

1ФГБНУ Всероссийский НИИ сельскохозяйственной
биотехнологии,

127550 Россия, г. Москва, ул. Тимирязевская, 42,
e-mail: marat131084@rambler.ru ✉; nv_varlamova@rambler.ru, marrod54@gmail.com, laraefremova@mail.ru, kharchenko@iab.ac.ru, den_vis@mail.ru;
2ФГБОУ ВО Российский государственный аграрный
университет—МСХА им. К.А. Тимирязева,

127550 Россия, г. Москва, ул. Тимирязевская, 49

Поступила в редакцию
11 декабря 2017 года

 

назад в начало