doi: 10.15389/agrobiology.2018.3.634rus

УДК 631.461.52:576:576.086

Работа выполнена на оборудовании ЦКП «Геномные технологии, протеомика и клеточная биология» ФГБНУ ВНИИСХМ и ЦКП «Клеточные и молекулярные технологии изучения растений и грибов» ФГБУН БИН РАН. Исследования поддержаны РНФ (грант № 16-16-10035).

 

МЕТОДИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ИЗУЧЕНИЯ ТУБУЛИНОВОГО
ЦИТОСКЕЛЕТА В КЛУБЕНЬКАХ БОБОВЫХ РАСТЕНИЙ

А.Б. КИТАЕВА1, П.Г. КУСАКИН1, К.Н. ДЕМЧЕНКО1,2, В.Е. ЦЫГАНОВ1

Открытие микротрубочек в растениях, а также их последующее изучение было связано с использованием электронной микроскопии. В дальнейшем разрабатывались способы визуализации цитоскелета в растительной клетке посредством иммунолокализации с применением флуоресцентной и лазерной сканирующей конфокальной микроскопии (K. Celler с соавт., 2016). Все перечисленные методы предполагают фиксацию анализируемого биологического материала. Однако тубулиновый цитоскелет — крайне динамичная структура, поэтому в последние годы активно развиваются методики прижизненного наблюдения микротрубочек с помощью флуоресцентных белков (K. Celler с соавт., 2016). Тем не менее, иммуногистохимический анализ все еще остается востребованным (J. Dyachok с соавт., 2016) в силу ряда причин. Так, прижизненные наблюдения ограничены клетками поверхностных слоев органов и тканей (корневые волоски, эпидерма) (F.M. Perrine-Walker с соавт., 2014; J. Dyachok с соавт., 2016). Более того, у многих видов растений размеры их органов намного крупнее, чем у Arabidopsis thaliana, что делает невозможным проведение анализа изменений в организации цитоскелета in vivo (J. Dyachok с соавт., 2016). Еще один ограничивающий фактор — трудности с проведением трансформации у некоторых видов растений, в частности у гороха (Pisum sativum) (A. Iantcheva с соавт., 2013). Поэтому сохраняется актуальность оптимизации протокола фиксации растительного материала для эффективного использования иммуногистохимического анализа тубулинового цитоскелета. Нами было показано, что такая оптимизация важна при вовлечении в исследования новых видов бобовых растений. Так, разработанный нами ранее протокол фиксации для гороха потребовал изменений при анализе паттерна микротрубочек в клубеньках Medicago truncatula. Модификации в используемом протоколе фиксации могут быть также необходимы при исследовании различных мутантов по симбиотическим генам у одного вида растений, так как такие мутации могут оказывать сильное влияние на физико-химические свойства тканей клубенька. Мы использовали разные протоколы фиксации для линии дикого типа M. truncatula A17, мутанта dnf-1 и мутантов efd-1 и TR3 (ipd3). Кроме того, в представляемой работе показано, что приготовление срезов фиксированных клубеньков с помощью микротома с вибрирующим лезвием позволяет значительно повысить сохранность структуры тубулинового цитоскелета по сравнению с использованием фиксированных образцов, заключенных в воск Стидмана, и последующим получением срезов на ротационном микротоме. Как оказалось, возраст клубеньков тоже существенно влияет на результаты визуализации тубулинового цитоскелета. При сравнении его паттернов тубулинового цитоскелета в разных типах клеток важную роль играет количественный анализ. Мы показали, что для такого анализа перспективно использование программы MicroFilament Analyzer (E. Jacques с соавт., 2013) с дополнительными сценариями проверки частоты встречаемости микротрубочек с определенной ориентацией.

Ключевые слова: бобово-ризобиальный симбиоз, микротрубочки, иммунолокализация, Pisum sativum, Medicago truncatula, количественный анализ, MicroFilament Analyzer.

 

Полный текст

 

KEY METHODOLOGICAL FEATURES OF TUBULIN CYTOSKELETON
STUDIES IN NODULES OF LEGUME PLANTS

A.B. Kitaeva1, P.G. Kusakin1, K.N. Demchenko1,2, V.E. Tsyganov1

The discovery of microtubules in plants, as well as their subsequent study, was made possible by the methods of electron microscopy. Further, methods for visualizing the cytoskeleton in a plant cell were actively developed using immunolocalization combined with laser scanning confocal microscopy (K. Celler et al., 2016). All the above-listed methods involve the fixation of the analyzed biological material. It should be noted that the tubulin cytoskeleton is an extremely dynamic structure; therefore, techniques of microtubule visualization in living plant cells using fluorescent proteins have been actively developed in recent years (K. Celler et al., 2016). Nevertheless, immunohistochemical analysis is still an essential method (J. Dyachok et al., 2016). First of all, this is due to the fact that in vivo observations are limited to plant cells of the surface layers (root hairs, epidermis) (F.M. Perrine-Walker et al., 2014; J. Dyachok et al., 2016). Moreover, for many plant species, the size of their organs is much larger than that of Arabidopsis thaliana, which makes it impossible to analyze changes in the organization of the cytoskeleton in vivo (J. Dyachok et al., 2016). Another limiting factor is that for several plant species, transformation protocols have not yet been developed or are very difficult, e.g., pea (Pisum sativum L.) (A. Iantcheva et al., 2013). In optimization of the protocols for effective immunohistochemical analysis of the tubulin cytoskeleton, the fixation of plant material is an important step. In our study, it was shown that this optimization is required when new legume species are studied. For instance, the protocol for pea nodule fixation developed by us required changes when applied to the nodules of Medicago truncatula. Moreover, modifications in the protocol for fixation may even be necessary when examining different mutants in the symbiotic genes of a plant species, because such mutations can exert a strong influence on the physicochemical properties of the nodule tissues. Therefore, we used various fixation protocols for the wild-type line of M. truncatula A17 and its mutants dnf1-1, efd-1 and TR3 (ipd3). It has also been shown that the preparation of sections of fixed nodules using a microtome with a vibrating blade can significantly improve the preservation of the structure of the tubulin cytoskeleton as compared to the use of fixed specimens embedded in Steedman’s wax and subsequent sectioning using a rotary microtome. It was found that the age of the nodules is also an important factor in the visualization of the tubulin cytoskeleton. To compare the patterns of tubulin cytoskeleton in different cell types, quantitative analysis is required. We found that the MicroFilament Analyzer (E. Jacques et al., 2013) with additional scripts seemed well suited for checking the frequency of microtubules with a given orientation.

Keywords: legume-rhizobial symbiosis, microtubules, immunolocalization, Pisum sativum, Medicago truncatula, quantitative analysis, MicroFilament Analyzer.

 

1ФГБНУ Всероссийский НИИ сельскохозяйственной
микробиологии,

196608 Россия, г. Санкт-Петербург—Пушкин, ш. Подбельского, 3,
e-mail: tsyganov@arriam.spb.ru ✉;
2ФГБУН Ботанический институт им. В.Л. Комарова РАН,
197376 Россия, г. Санкт-Петербург, ул. Профессора Попова, 2,
e-mail: demchenko@binran.ru

Поступила в редакцию
29 ноября 2017 года

 

назад в начало