doi: 10.15389/agrobiology.2017.3.588rus

УДК 631.461:577.2

Сбор почвенных образцов, проведение химических анализов почв и субстратов для микробиологического разрушения (целлюлозы и соломы) осуществлялись за счет Программы фундаментальных исследований Президиума РАН; работы по выделению ДНК, секвенированию и биоинформационному анализу данных были проведены за счет финансовой поддержки гранта РНФ № 14-26-00094.

 

ДИНАМИКА МИКРОБНОГО СООБЩЕСТВА ТИПИЧНОГО ЧЕРНОЗЕМА
ПРИ БИОДЕГРАДАЦИИ ЦЕЛЛЮЛОЗЫ И СОЛОМЫ ЯЧМЕНЯ

Е.Л. ЧИРАК1, О.В. ОРЛОВА1, Т.С. АКСЕНОВА1, А.А. КИЧКО1,
Е.Р. ЧИРАК1, Н.А. ПРОВОРОВ1, Е.Е. АНДРОНОВ1, 2
, 3

Изучение процессов разложения целлюлозы — важное направление исследований для сельскохозяйственной науки, поскольку солома служит одним из самых доступных органических удобрений. Было проведено большое число работ, направленных на исследование биохимических механизмов разрушения целлюлозы, а также оценку таксономического разнообразия целлюлозолитических микроорганизмов. Однако состав микробного сообщества оценивался только с помощью методов, основанных на культивировании и, как следствие, обнаруживающих небольшую часть почвенного микробиома. С появлением методов секвенирования нового поколения (NGS) открылась возможность анализа сообщества микроорганизмов через обнаруженные в почве копии гена 16S рРНК. Основной задачей представленной работы была реализация комплексного подхода, сочетающего классические агрохимические методы оценки интенсивности процессов биоразложения с современными молекулярными методами (анализ почвенного метагенома 16S рРНК), для изучения динамики микробных сообществ, разлагающих два субстрата, содержащих целлюлозу, — солому и фильтровальную бумагу. С помощью метода высокопроизводительного секвенирования мы впервые показали, что при внесении в почву соломы наблюдаются более глубокие изменения структуры микробного сообщества, чем при внесении химически чистой целлюлозы. Модельный опыт проводили на типичном черноземе, отобранном в Воронежской области на залежных участках с глубины 2-15 см. В почву вносили химически чистую целлюлозу в виде сильно измельченной фильтровальной бумаги и измельченную солому ячменя из расчета 1 г на 100 г почвы. Анализы проводили в день внесения субстратов (0-е сут), а также на 7-е, 14-е, 21-е и 28-е сут. Оценивали выделение СО2, содержание нитратов, аммонийного азота, лабильного углерода, микробной биомассы. Таксономическую структуру микробиома определяли на основании анализа тотальной ДНК. В первые 7 сут эксперимента в варианте с соломой наблюдали прирост биомассы и связанную с этим активизацию дыхательных процессов. В опыте с целлюлозой значительного прироста биомассы не наблюдалось, а дыхание активизировалось с задержкой. Внесение целлюлозы и соломы снизило содержание нитратного азота в почве относительно контроля, причем в варианте с соломой показатель снизился в меньшей степени. В течение опыта были обнаружены таксоны, численность которых как увеличивалась (Chthoniobacteraceae, Xanthomonadaceae, Chitinophagaceae), так и уменьшалась (Gaiellaceae). Среди первых встречались классические целлюлозолитики (Chitinophaga и представители семейств Streptosporangiaceae и Micromonosporaceae) и бактерии, пока не замеченные в процессах биодеградации (Chthoniobacter, Chitinophaga). При разложении целлюлозы было обнаружено проявление гомеостаза сообщества — значимые изменения состава микроорганизмов на 14-е сут эксперимента с восстановлением до исходного состояния на 28-е сут. Полученные нами данные об изменениях микробиома при внесении сломы и химически чистой целлюлозы могут служить основой для построения предикативных моделей динамики микробиомов в процессе разложения органического вещества в зависимости от типа разлагаемого субстрата и физико-химических особенностей почвы.

Ключевые слова: микробиом, почва, метагеном, солома, целлюлоза, биоразложение.

 

Полный текст

 

 

DYNAMICS OF CHERNOZEM MICROBIAL COMMUNITY DURING
BIODEGRADATION OF CELLULOSE AND BARLEY STRAW

E.L. Chirak1, O.V. Orlova1, T.S. Aksenova1, A.A. Kichko1,
E.R. Chirak1, N.A. Provorov1, E.E. Andronov1, 2
, 3

Study of cellulose decomposition is an extremely important for the agricultural sciences, as straw is one of the most affordable organic fertilizers. In this area, a large number of research works devoted to biochemical mechanisms of cellulose destruction, as well as study of the cellulolytic microorganisms’ taxonomic diversity were conducted. However, the composition of the microbial community was estimated only by the methods based on cultivation and thus describing only a very small part of the soil microbiome. With the advent of «new generation sequencing» methods the analysis of whole microbial communities found in the soil became possible. The main objective of this work was the implementation of an integrated approach, combining agrochemical techniques of biodegradation processes intensity estimation with modern molecular methods (soil metagenome analysis of 16S rRNA) in the process of cellulose decomposition in two substrates (straw and filter paper). It was first shown by the method of high-throughput sequencing that the introduction of a straw in soil caused dipper changes in the structure of the microbial community than the introduction of chemically pure cellulose. The model experiment was carried out on typical chernozem, sampled in the Voronezh region in fallow areas from a depth of 2-15 cm. Chemically pure cellulose (very fine-chopped filter paper) and crushed straw of barley were added at 1 g per 100 g of soil. Analyzes were performed on days 0, 7, 14, 21 and 28. CO2 emission, the content of nitrates, ammonium nitrogen, labile carbon, and microbial biomass were estimated. During the first 7 days, microbial mass and respiration increased when straw was added. For cellulose, an increase in biomass was not significant, and respiration was activated with a delay. The introduction of cellulose and straw reduced the soil level of nitrate nitrogen compared to control, and with straw, the indicator lowered to a lesser extent. In this work, some taxa were found, the proportion of which increased (Chthoniobacteraceae, Xanthomonadaceae, Chitinophagaceae), and decreased (Gaiellaceae). Among the microorganisms whose proportion increased after the introduction of cellulose, we found classic cellulose destructors (Chitinophaga and representatives of the families Streptosporangiaceae and Micromonosporaceae), and microorganisms whose ability to decompose cellulose had not previously been reported yet (Chthoniobacter, Chitinophaga). Community homeostasis was found (i.e. significant changes in the composition of microbiome on day 14 of the experiment returned to the original state on day 28). Agrochemical analysis (dynamics of nitrate nitrogen content, the rate of release of carbon dioxide, dynamics of bacterial biomass) fully agreed with the analysis of metagenomic data in fact that the microbial community actively respond to the introduction of straw as opposed to the introduction of pure cellulose.

Keywords: microbiome, soil, metagenome, straw, cellulose, biodegradation.

 

1ФГБНУ Всероссийский НИИ сельскохозяйственной микробиологии,
196608 Россия, г. Санкт-Петербург—Пушкин,
ш. Подбельского, 3,
e-mail: biologartillerist@gmail.com, arriam2008@yandex.ru;
2ФГБОУ ВО Санкт-Петербургский
государственный университет
,
199034 Россия, г. Санкт-Петербург, Университетская наб., 7-9,;
3ФГБНУ Почвенный институт им. В.В. Докучаева,
397463 Россия, г. Москва, Пыжевский пер., 7,
стр. 2

Поступила в редакцию
14 июня 2016 года

 

назад в начало