doi: 10.15389/agrobiology.2015.3.288rus
УДК 631.522/.524:577.21:575.224.46
Работа поддержана грантами РФФИ 14-04-32289-мол_а и 14-04-01442-а.
TILLING — СОВРЕМЕННАЯ ТЕХНОЛОГИЯ «ОБРАТНОЙ» ГЕНЕТИКИ
РАСТЕНИЙ (обзор)
А.С. СУЛИМА, В.А. ЖУКОВ
В генетических исследованиях существует два основных подхода, получивших названия «прямой» и «обратной» генетики. В то время как «прямая» генетика занимается изучением закономерностей наследования признаков (фенотипа) у живых организмов в ряду поколений и выявляет генетические факторы, которые влияют на проявление данных признаков (работает по принципу «от фенотипа к генотипу»), «обратная» генетика, имея в качестве отправной точки ген с неизвестной функцией, выясняет его роль в организме путем изменения структуры или активности такого гена с последующим анализом ассоциированных изменений в фенотипе (принцип «от генотипа к фенотипу»). С развитием технологий широкомасштабного геномного секвенирования «обратная» генетика получила существенную поддержку, заняв лидирующее положение как в фундаментальной науке, так и в прикладных областях. В представленном обзоре изложены принципы, лежащие в основе одного из новейших методов «обратной» генетики, получившего название TILLING (от англ. Targeting Induced Local Lesions in Genomes — поиск индуцированных локальных нарушений в геномах). Метод совмещает классический мутационный анализ с современными способами точного выявления нуклеотидных замен в заданном локусе. Отличительные особенности метода — высокая эффективность и применимость к широкому кругу биологических объектов, благодаря чему он успел завоевать широкое признание в научном мире. Подробно описаны ключевые этапы подготовки к TILLING-анализу: получение мутагенизированной популяции исследуемых организмов и создание на ее основе так называемой TILLING-платформы, включающей организованную коллекцию мутантов и связанную с ней базу данных с информацией о коллекции. Приведены основные подходы к детекции точечных мутаций, применяемые в настоящее время мировыми исследовательскими группами, в том числе новейшие подходы на основе методов NGS (от англ. Next Generation Sequencing — «секвенирование следующего поколения»). Особое внимание уделено требованиям, предъявляемым к исследователям для успешного проведения TILLING-анализа, а также существующим вариациям и модификациям метода, призванным решать различные задачи. Отдельно представлены результаты, полученные коллективом авторов с применением методики TILLING в их исследованиях специфичности распознавания партнеров при установлении мутуалистического симбиоза между горохом посевным (Pisum sativum L.) и клубеньковой бактерией Rhizobium leguminosarum bv. viciae. Благодаря TILLING-анализу авторам удалось выявить ряд мутантов гороха по гену рецепторной киназы LykX, который представляется наиболее вероятным кандидатом на роль детерминанты повышенной избирательности растения к бактериальному микросимбионту. Исследование полученных мутантов поможет сделать окончательное заключение о роли гена LykXв симбиозе гороха и клубеньковых бактерий.
Ключевые слова: генетика растений, «обратная» генетика, TILLING, выявление мутаций, горох посевной, «афганский» фенотип.
TILLING: THE MODERN TECHNOLOGY IN «REVERSE» GENETIC
OF PLANTS
(review)
A.S. Sulima, V.A. Zhukov
There are two basic approaches in genetic studies called «forward» and «reverse» genetics. While the «forward» genetics studies the inheritance of traits (phenotype) in living organisms and identifies genetic factors that influence the expression of these traits (working on the principle of «from phenotype to genotype»), the «reverse» genetics reveals the function of gene by changing its structure or activity with subsequent analysis of the associated changes in phenotype (the «from genotype to phenotype» principle). With the development of large-scale genomic sequencing technologies the «reverse» genetics received substantial support, taking the leading position both in scientific and applied fields. Basic principles underlying the novel method of «reverse» genetics called TILLING (for Targeting Induced Local Lesions IN Genomes) are reviewed in this paper. TILLING combines the classic mutation analysis with modern approaches to detecting the nucleotide substitutions in a target locus in genome. The method is highly effective and is applicable to a wide range of biological objects, thereby winning a world-wide recognition. The key stages of preparation for TILLING analysis are described: obtaining of mutagenized population and development of TILLING platform, which includes the organized collection of mutants and database with information about the collection. The main approaches to the detection of point mutations currently used worldwide, including new approaches based on NGS methods (Next Generation Sequencing), are presented. The technical requirements crucial for the successful conducting of TILLING-analysis, as well as variations and modifications of existing techniques designed to solve various scientific tasks, are highlighted. The results obtained using the TILLING method by the group of authors in their research of specificity of partners recognition during the development of mutualistic symbiosis between the garden pea (Pisum sativum L.) and nodule bacteria Rhizobium leguminosarum bv. viciae are also presented. Authors were able to identify a number of mutants in pea receptor kinase gene LykX, which is the most likely candidate for the determinant of plant’s increased selectivity toward bacterial microsymbionts. Further study of obtained mutants will help to reveal the function of LykX and its role in symbiosis between pea and nodule bacteria.
Keywords: plant genetics, «reverse» genetics, TILLING, detection of mutations, pea, «Afghan» phenotype.
ФГБНУ Всероссийский НИИ сельскохозяйственной |
Поступила в редакцию |
Оформление электронного оттиска
