doi: 10.15389/agrobiology.2015.3.332rus
УДК 579.64:577.22
Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации (Соглашение № 14.604.21.0024, RFMEFI60414X0024).
ПОЛНОГЕНОМНОЕ СЕКВЕНИРОВАНИЕ И СРАВНИТЕЛЬНЫЙ
АНАЛИЗ ГЕНОВ «ДОМАШНЕГО ХОЗЯЙСТВА» И ВИРУЛЕНТНОСТИ У
КОММЕРЧЕСКИХ ШТАММОВ Bacillus thuringiensis С ЭНТОМОЦИДНЫМ
ДЕЙСТВИЕМ
В.И. САФРОНОВА, А.Л. САЗАНОВА, И.Г. КУЗНЕЦОВА, Ж.П. ПОПОВА,
С.Д. ГРИШЕЧКИНА, В.П. ЕРМОЛОВА, Е.Е. АНДРОНОВ
Ведомственная коллекция полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения (ВКСМ) поддерживает 37 штаммов Bacillus thuringiensis, обладающих выраженной энтомоцидной активностью и используемых для производства препаратов фитозащитного действия (битоксибациллин, бактокулицид, бацикол). Эффективность производимых биопрепаратов зависит от качества микробного материала. Контроль за чистотой и аутентичностью коммерческих штаммов может осуществляться с помощью их молекулярно-генетической паспортизации. В настоящее время наиболее эффективной технологией доскональной генетической характеристики штаммов микроорганизмов считается полногеномное секвенирование. Однако, несмотря на несомненную востребованность полногеномного секвенирования для паспортизации коммерческих штаммов, ее широкое применение ограничивается значительной трудозатратностью и себестоимостью. Поэтому для удешевления анализа и сокращения сроков его выполнения необходима разработка экспресс-методов высокопроизводительного секвенирования. Одним из решений может быть анализ не всего генома, а наиболее таксономически и функционально значимых генетических локусов (так называемого референт-комплекса). Целью нашей работы стало выявление референт-комплексов у 10 штаммов B. thuringiensis разных серотипов. После проведения высокопроизводительного пиросеквенирования штаммов и получения полногеномных последовательностей был проведен их сравнительный анализ и найдены наиболее дивергентные генетические локусы, определяющие уникальность штаммов. Использовали программу BioNumerics («Applied Maths», США); для построения дендрограмм, отражающих филогенетическое родство между исследуемыми штаммами, суммы последовательностей отобранных генов «домашнего хозяйства» и отдельно генов вирулентности обрабатывали с помощью программы MEGA v. 5.0 (метод Neighbour-Joining). В результате были отобраны 10 генов «домашнего хозяйства» (glpT, glpF, pyrE, purF, purH, pta, gyrB, ftsA, panCиisd), а также 8 генов вирулентности (hblA, hblC, hblD, nheA, nheC, capA, capCиinA). Для каждого штамма сконструированы два референт-комплекса, представляющих собой сумму последовательностей отобранных локусов «домашнего хозяйства» и отдельно генов вирулентности. Общий размер референт-комплексов составлял соответственно 11809 и 10094 п.н. Полученные результаты будут использованы в дальнейшей работе для создания системы праймеров с целью проведения мультиплексного анализа референт-комплексов в условиях высокопроизводительного секвенирования и разработки экспресс-метода генетической паспортизации коммерческих штаммов B. thuringiensis.
Ключевые слова: Bacillus thuringiensis, полногеномное секвенирование, гены «домашнего хозяйства» и вирулентности, генетическая паспортизация.
V.I. Safronova, A.L. Sazanova, I.G. Kuznetsova, Zh.P. Popova,
S.D. Grishechkina, V.P. Ermolova, E.E. Andronov
Russian collection of agricultural microorganisms (RCAM) supports 37 strains of Bacillus thuringiensis with pronounced insecticidal activities, which are used for the production of phytoprotective biopreparations. The effectiveness of biopreparations depends on the quality of the microbial material. Monitoring of the purity and authenticity of the commercial strains can be accomplished by their molecular-genetic certification. Currently, the most effective technology for detailed genetic characterization of strains is a whole genome sequencing. However, despite the obvious demand for whole genome sequencing for the certification of commercial strains, its widespread use is limited because of considerable labour-intensive and cost. Therefore, the developing of rapid methods for high-throughput sequencing is necessary to reduce the cost of analysis and the terms of its implementation. One possible solution might be to analyze the part of genome, which includes the most taxonomically and functionally important genetic loci (referent-complexes). The goal of this work was to detect the referent-complexes of 10 B. thuringiensis strains having different serotypes. After receiving whole genome sequences the comparative analysis was carried out to search for the most divergent genetic loci that determine the uniqueness of strains. To identify most divergent loci of housekeeping genes and virulence genes in the strains, we used BioNumerics («Applied Maths», USA) program and MEGA v. 5.0 program for clustering according to Neighbour-Joining method. As a result, 10 housekeeping genes (glpT, glpF, pyrE, purF, purH, pta, gyrB, ftsA, panCand isd), as well as 8 virulence genes (hblA, hblC, hblD, nheA, nheC, capA, capCand inA) were selected. For each strain two referent complexes were constructed, representing the concatenated sequences of selected housekeeping and virulence loci taken separately. Total length of the referent-complexes was 11809 and 10094 bp respectively. In the future the sets of primers will be created for multiplex analysis of referent complexes in the high-throughput DNA sequencing and the rapid method for genetic certification of the commercial B. thuringiensis strains will be developed.
Keywords: Bacillus thuringiensis, whole genome DNA sequencing, housekeeping and virulence genes, genetic certification.
ФГБНУ Всероссийский НИИ сельскохозяйственной |
Поступила в редакцию |
Оформление электронного оттиска
